私たちのプロトコルは、ソルガム植物の開発と干ばつ耐性のためのエピジェネティックマーカーを発見します。このような分子理解は、将来の極端な気候に合わせて作物を適応させるより良い解決策を開発するのに役立ちます。このプロトコルは、質量分析による翻訳後修飾の非標的プロファイリングに適したソルガム葉組織から高純度ヒストンを生成する。
この手順のデモンストレーションは、EMSLの独身後の研究員であるシャダン・アブダリとターニャ・ウィンクラーです。まず、液体窒素でいくつかのソルガムの葉を粉砕し、マイナス80度の50ミリリットル遠心管に保存します。各サンプルのヒストン分析には約4グラムの葉粉末を使用してください。
テキスト原稿に記載されているように抽出バッファー1、2A、および2Bを調製し、抽出バッファー1にプロテアーゼ阻害剤錠剤を添加して、0.2Xの最終濃度を作る。その後、調製した抽出バッファーの 1 つを 1 本ずつ地葉粉末に加え、10 分間静かに混合または渦を混ぜます。メッシュ100を用いて、濾過した材料を2ミリリットルの抽出バッファーを1回ずつ2回リンスする。
次に、振るバケツローターで摂氏4度で10分間Gの3,000倍の濾液を遠心分離し、細胞デブリおよび大きな細胞内小器官をペレットする。同時に、0.4Xの最終濃度にプロテアーゼ阻害剤を添加して抽出緩衝液2Aを調製する。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
次に、調製した抽出バッファー2Aの5ミリリットルにペレットを再懸濁する。氷の上で10分間、穏やかな混合でインキュベートします。2,100回Gで溶液を振るバケツローターで摂氏4度で15分間遠心分離し、破片および核をペレット化する。
ペレットを邪魔することなく上清を慎重にデカントします。抽出緩衝液2Bを、1Xの最終濃度にプロテアーゼ阻害剤を添加して調製する。この調製したバッファーの 5 ミリリットルを遠心分離後に得られたペレットに加えます。
2で遠心分離機2、100回Gを4°Cで15分間ペレットデブリおよび核に振る。同時に、プロテアーゼ阻害剤を錠剤に添加して核ライシス緩衝液を調製する。慎重にペレットを乱すことなく上清をデカントし、リシスバッファーの250マイクロリットルでペレットを再懸濁します。
溶液を最高速度で15秒間ボルテックスして均質化し、材料を再懸濁させる。その後、摂氏4度で5分間超音波処理し、マイナス80度で保存します。凍結した核試料を解凍し、5%グアニジンバッファーの750マイクロリットルを加える。
その後、摂氏4度で15分間超音波処理します。サンプルを2ミリリットルチューブに移し、摂氏4度で10分間Gの10,000倍に回転させます。同時に、イオン交換クロマトグラフィーカラムを2ミリリットルのアセトニトリルと4ミリリットルの水でリンスして、表面の汚染を最小限に抑えます。
弱カチオン交換樹脂を約200~300マイクロリットルのクロマトグラフィーカラムに積み込み、樹脂を落ち着かせる。ゲルをグアニジンバッファーで樹脂を 4 回洗浄し、チューブとカラムを氷の上に置きます。2ミリリットルの回収チューブにカラムを置き、樹脂を破壊することなく、準備したサンプルから上澄みをゆっくりと樹脂ベッドに積み込みます。
溶液が流れ込む中、溶出液をカラムの上部に6~8回戻し、樹脂への最大結合を可能にします。その後、5%グアニジンバッファーの2ミリリットルをロードし、非ヒストンタンパク質をカラムから洗い流します。ヒストンタンパク質を5%グアニジンバッファーの1ミリリットルで溶出し、溶出液を収集します。
洗浄溶媒500マイクロリットルで3キロダルトンカットオフスピンフィルターを洗浄し、その後、事前に洗浄されたスピンフィルターを使用して残りの溶出物を脱塩します。主要ヒストンタンパク質は、実験の成功を示すLC-MS特徴マップの特定の領域で観察された。この代表的なマップは、破線のボックスに完全な長さのヒストンをそのまま表示します。
H2Bと16キロダルトンH2AプロテオフォームのLC-MS特徴マップは、両方ともユニークな製品セッション番号で示されているように、類似した配列を持つ複数のホモログを有することを示しています。延長された尾を持たないH2Aヒストンの別のグループが見られる。N末端アセチル化、追加のリジンアセチル化、およびH4ヒストンタンパク質におけるメチオニン酸化は、ここに示すLC-MS特徴マップの質量差を調べることによって観察することができる。
H3ヒストンタンパク質に対して同定された2つのタンパク質配列、H3.3およびH3.2があった。電子伝達解離断片化は、同定されたH3.2プロテオフォームの断片化スペクトルを生成するために使用した。前駆体イオンと前および次のMs1スペクトルは、一致した同位体のピークが紫色で強調表示された状態でここに示されています。
翻訳後の変更は、シーケンス カバレッジ マップを使用してローカライズできます。プロテオフォームの相対的な存在量を比較することにより、サンプル条件に特異的な切り捨てられたヒストンプロテオフォームの変化が発見された。H4のC末端切り捨ては、いくつかのサンプルについて3週と9週間でしか観察されなかった。
H3.2の場合、N末端切り捨てプロテオフォームは一般的に第10週でより豊富であった。これに対し、C端子切り捨てH3.2は以前の時点で見られました。H4 C末端切り捨てプロテオフォームは、RTx430よりもBTx642に有意に豊富であった。
このプロトコルを試みるとき、上清とペレットの色に細心の注意を払ってください。色の変化は、葉葉芽細胞の粉砕またはリシスの潜在的な問題を特定するのに役立ちます。私たちは、ソルガム葉からのヒストン分離のためのこの堅牢なプロトコルが、他の同様の植物のエピジェネティック研究を可能にすることを願っています。
