この方法は、細胞培養実験用に備え付けられた任意の実験室で行うことができる。この方法を用いることで、腎の発達や疾患経路の理解を深めることができます。これは、腎臓オルガノイドを生成するための他のものと比較して比較的簡単で安価な方法である。
この技術の最大の課題は、高品質のヒト多能性幹細胞培養を維持することです。細胞が80%未満のコンフルエンシーに維持され、定期的に分裂することが重要です。ヒト多能性幹細胞培養を初めて使用する研究者は、分化に進む前に幹細胞株に慣れておく必要があります。
腎臓オルガノイドアッセイを開始するには、2ミリリットルの完全E5-ILP培地を6ウェル超低付着プレートの各ウェルに加えます。ヒト多能性幹細胞(hPSC)を100ミリメートルの組織培養処理プレートで、60%コンフルエントに達するまで培養する。hPSCを約8ミリリットルのDPBで2回洗浄する。
DPBSを吸引し、次に細胞を覆うために2ミリリットルのディスパーゼを滴下し、摂氏37度で6分間インキュベートする。約10ミリリットルのDPBSで細胞を3回洗浄する。DPBSを吸引し、プレートを45度傾け、セルリフターでセルをこすり落とします。
10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、6ミリリットルの完全E5-ILP培地でコロニーを上から洗い流します。その後、ピペットを垂直に保持し、上下に緩やかにピペッティングすることにより大きなコロニーを分裂させ、培養プレートの側面に触れないように注意する。6ウェルプレートにウェルあたり1ミリリットルを加えてコロニークラスターを均等に分配し、プレートを摂氏37度のインキュベーター内のオービタルシェーカーに置きます。
あるいは、オービタルシェーカーが利用できない場合、細胞を静的に培養することができる。2日目に、胚様体をプレートの底に落ち着かせた後、プレートを45度傾け、上からゆっくりと培地を吸引し、ウェルあたり1ミリリットルを残します。ウェルあたり2ミリリットルの調製された完全培地を加え、プレートをシェーカーに戻す。
3日目に、前述のように培地を吸引した後、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して各ウェルからすべての胚様体を慎重に収集し、50ミリリットルの円錐管に移す。残りの胚様体を採取するには、1ミリリットルの低グルコースDMEMで各ウェルをすすぎ、それらを同じ50ミリリットルの円錐形チューブに加える。胚様体がチューブの底部に沈降するのを待っている間に、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルのステージII培地を加える。
次に、新しい50ミリリットルの円錐形のチューブの上に200マイクロメートルのセルストレーナーを置き、すべての胚様体をセルストレーナーの上に慎重にピペッティングすることによって、大きな胚様体をふるいにかけます。さらに5ミリリットルのDMEMでセルストレーナーをすすぎ、ストレーナーに詰まった胚様体を採取します。後の段階では、まず500マイクロメートルのストレーナーを使用して非常に大きな胚様体をふるいにかけ、次に濾液を200マイクロメートルのストレーナーに通して、細管のない非常に小さな胚様体をふるいにかけます。
200マイクロメートルのストレーナーを新しい50ミリリットルのチューブに反転させ、DPBSでストレーナーを洗浄することによって、200〜500マイクロメートルの正しいサイズの胚様体を収集します。こすり傷の後、胚様体を円錐管の底に沈降させ、上清を吸引し、約10ミリリットルのDMEMで洗浄する。次いで、胚様体を6ミリリットルのステージII培地に再懸濁する。
胚様体を6ウェル超低付着プレートに戻し、ウェル間で均等に分配する。オルガノイドのほとんどはピペットの上部に集まるので、最後に約0.5ミリリットルを残してから、各ウェル内の培地に先端を優しく触れ、オルガノイドがウェルに流れ込むようにします。胚様体を、45ミリリットルのステージII培地を含む125ミリリットルのスピナーフラスコに移す。
マグネチックスターリング速度を120rpmに設定し、フラスコをインキュベーターに入れた。胚様体または腎臓オルガノイドに餌を与えるには、スピナーフラスコの底に短時間落ち着かせてから、フラスコの片側アームから蓋を持ち上げ、先端が反対側の内壁に触れた状態で吸引ピペットを内部に置きます。ピペットをゆっくりと傾け、培地の約半分を吸引します。
20ミリリットルの新鮮なステージII培地を同じ開口部からピペッティングして補充します。長い滅菌鉗子を使用して、胚様体または腎臓オルガノイドを含む6ウェルプレートの各ウェルに1つの磁気攪拌子を慎重に配置します。プレートを6輪マグネチックスタープレートの上に置き、速度を120rpmに設定した。
マグネチックスターバーを所定の位置にカチッと収めて回転を開始するには、まず出力レベルを100に設定します。すべてのバーが回転し始めたら、パワーレベルを25に下げます。以前に実証したように培地の半分を変えることによって腎臓オルガノイドを維持する。
14日目の腎臓オルガノイドのパラフィン切片の免疫蛍光は、肝細胞核因子-1βおよびLotus tetragonolobus lectinを発現する腎尿細管などのネフロンセグメント、ならびにV-maf筋腱膜神経症性線維肉腫癌遺伝子ホモログBおよびネフリンを発現する有蹄細胞クラスターの存在を示す。このプロトコールにおける改変は、培養26日目に血小板および内皮細胞接着分子-1による染色によって確認されるように、内皮細胞の拡大を支持することができる。ヒト多能性幹細胞は、適切な時間ディスパーゼで処理し、その後、すべての痕跡を除去するために十分に洗浄する必要がある。
ディスパーゼが完全に除去されない場合、細胞死および胚様体のクラスタリングにつながる可能性がある。この方法は、先天性腎臓病の発症、ならびに様々な腎臓傷害経路およびインビトロでの治療介入の可能性を調べるのに役立った。
