このプロトコルは、人工多能性幹細胞を使用して肺細胞に分化し、ヒト肺疾患および皿の発達をモデル化する。このプロトコルは、初発ヒト肺組織を得て培養することが困難であるため、重要である。多能性幹細胞から肺細胞を分化する主な利点は、ヒトの肺の発達と疾患を研究するために特定の肺細胞を一定に供給することです。
これらの細胞は、長期間細胞培養中に維持することができ、将来の用途のために凍結保存することができ、遺伝子変異を研究するために遺伝的に操作することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士候補生であるレイチェル・マクヴィカーです。実験を開始する前に、成長因子をゆっくりと解凍して、氷上の基基膜マトリックス培地であるGFRを、同量の冷たいDMEM F12で希釈する。
P1000のチップを冷凍庫に入れ、使用前に冷やします。次に、50%GFR基膜マトリックス培地の500マイクロリットルで12ウェルプレートの各ウェルをコーティングし、ウェルから余分な培地混合物と気泡を除去します。ウェルプレートを湿った氷の上に置くか、冷蔵庫を摂氏4度で20分間セットし、プレートを一晩で37度の摂氏インキュベーターに移動します。
高いPSEが70%の合流度に達したら、ヒト人工多能性幹細胞に10マイクロモルROCK阻害剤Y27632を加え、解離する前に1時間待ちます。培地を吸引し、PVSで細胞を一度洗う。1ウェルあたり500マイクロリットルの細胞剥離培地を添加してIPSCを解離し、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で20分間インキュベートする。
インキュベーション後、ウェルあたり500マイクロリットルの幹細胞通過媒体を加える。P1000チップを用いてピペット細胞を穏やかに使用し、単一の細胞懸濁液を得た。次いで、解約した細胞を15ミリリットルチューブと遠心分離機に300回G.後遠心分離で5分間移し、培地を吸引し、1ミリリットルのmTeSR Plus培地で細胞ペレットを10ミクロモルROCK阻害剤を補充して再懸濁する。
細胞を数えた後、12ウェルGFR培地コーティングされたプレートの各ウェルに5番目のIPSCに2回10を加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、mTeSR Plusを吸引してから、決定的な内胚葉(DE)誘導媒体を追加します。2 日目と 3 日目に、DE 誘導媒体を変更します。
4日目に、DE誘導培地を無血清基底培地に置き換えてAFE誘導を開始します。6 日目の終わりに AFE 効率を分析する前に、AFE 培地を毎日 3 日間変更します。7日目に、後で使用するために氷上のGFR基質膜マトリックス培地を解凍する。
同時に、AFE培地を吸引し、PVSでウェルを洗浄することにより、肺前駆細胞分化を進める。ウェルに1ミリリットルの細胞剥離液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞剥離液を含むウェルズに1ミリリットルの焼入れ培地を加えます。
上下に軽くピペットを入れ、細胞を凝集体として保持します。すべての細胞が外れているが、5分間Gの300倍で遠心のために15ミリリットルの円錐管に移すため。上清を除去し、LPC誘導培地中の細胞ペレットを再懸濁します。
細胞を数え、5番目の細胞に2.5倍の10を冷たいGFR基質膜マトリックス培地の100マイクロリットルに加え、よく混ぜます。12ウェルプレートのウェルに液滴を入れ、30〜60分間摂氏37度でインキュベートします。次に、ウェルあたり1ミリリットルのLPC培地を加え、培地の低下が完全に水没し、摂氏37度で一晩インキュベートされるようにします。
8日目に、LPC培地を変更してROCK阻害剤Y27632を除去します。1日おきにメディアを交換し続け、16日目の終わりにLPC効率を分析します。17日目には、井戸を洗い、1ミリリットルのディスパーゼあたり2マイクログラムの500マイクロリットルを加えます。
P1000ピペットを用いてディスパーゼ混合物をピペットし、15分間インキュベートし、その混合物をピペット化し、さらに15分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、焼入れ培地の1ミリリットルをウェルを含むディスパーゼに加え、細胞を円錐管に移します。遠心分離機を1ミリリットルの冷蔵PVSで再懸濁し、遠心分離を繰り返します。
その後、細胞剥離培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁する。37°Cで12分間細胞をインキュベートし、同じ量の焼入れ培地と遠心分離機を再び加えます。クエンチ培地の1ミリリットルおよび10マイクロモルロック阻害剤Y27632でペレットを再懸濁する。
ウェルあたり8倍の10〜4番目のセルを得るために必要な体積を計算するためにセルカウントを実行します。次に、必要なLPC細胞の体積は1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに、遠心分離機は300倍G.細胞ペレットを攪拌せずに余分な上清を除去し、10マイクロリットルの残留培地を残した。細胞ペレットを200マイクロリットルの冷たいGFR基底膜マトリックス培地に再懸濁し、細胞を細胞培養膜挿入物に移す。
摂氏37度で30~60分インキュベートします。インキュベーション後、3Dオルガンイド誘導培地を1ミリリットルをインサートのバソラテラチャンバーに加え、1日おきに新鮮な培地に6日間交換します。23日目に、培地を3D分岐媒体に切り替え、その後、6日間隔日培地を交換します。
29日目に、3D成熟培地に変更し、次の6日間、一日おきに培地を交換し続けます。DE誘導の4日目に、結合された細胞はコンパクトな石畳の形態を示す。核で重ね合わされた決定的な内胚葉マーカーCXCR4およびSOX17を発現させ、エンドダーマル分化を確認した。
前前腸誘導は7日目に確認され、より緊密に圧縮された細胞を示す形態と、FOXA2およびSOX2のマーカーが核で重ね合わされた。3D肺前駆細胞の生成を3Dスフェロイドで確認し、レポーター細胞株中のNKX2-1 GFPの内因性発現を確認した。肺オルガノイド全体への3週間分化後、肺マーカーを免疫細胞化学によって分析した。
器官では、核によって重ねられた形態形成の分岐用マーカーSOX2およびSOX9が観察された。近位肺マーカーP63とKRT5は、両方の基底細胞マーカーであり、クラブ細胞のマーカーであるSCGB3A2と共に正常に検出された。遠位肺マーカーは、肺胞タイプII細胞のプロSPCおよびSPBマーカーを誘導した。
そして、肺胞型I細胞のHOPXマーカー。さらに、NKX2-1およびZO1は核で重ね合って発現した。間葉系肺細胞マーカーPGFRアルファは、SOX9と共発現する線維芽細胞のマーカーであり、遠位間葉系を表した。
ビメンチンも発現し、肺全体に分散させた。この手順に従って、肺オルガノイドは、内皮および免疫細胞由来の誘導多能性幹細胞に投資することができる。肺の発達と疾患は、上皮細胞と間葉系細胞集団の間のシグナル伝達によって生じるが、内皮細胞およびマクロファージからのシグナル伝達も起こる。
3D肺組織モデルシステムは、ヒトの疾患および治療の研究に臨床的に関連する。
