疾患モデル作製のひと 3 D 肺組織培養 (3 D-Ltc) の生成

この方法は、自然な3D構造と潜在的な治療法への主要な実験室所見の翻訳のための組成の生きているヒト組織の調査を可能にする。この技術は、個々の死亡した患者肺組織サンプルの可視化のために、外科的に切除またはヒト肺組織を植え替えることから組織培養物を特異的に生成可能にする。疾患のない肺組織は、肺疾患をモデル化する3D組織培養物として使用することができ、高い時空間分解能で早期の病態機構の解析を可能にする。

切除された肺サンプルを無菌15センチメートルの培養皿とティッシュペーパーで覆われた滅菌金属トレイの培養培地の15ミリリットルに入れ、30ミリリットルの注射器に42°Cの低融点アガロースを充填します。末梢静脈カテーテルから閉塞器を取り外し、カテーテルを30ミリリットルのシリンジに取り付けます。換気組織の直径0.5~3ミリメートルの気管支を、組織の無傷の部分で識別し、できるだけ気管支にカヌラをそっと挿入します。

鉗子を使用して、カヌラの周りの気管支壁を圧縮し、理想的には隣接する肺動脈を同時にクランプし、カヌラの周りの気管支を密閉し、他の追加の気道を閉塞させるために外科用クランプを使用して、アガロース漏れを防ぎます。次に、鉗子を使用して培養皿から肺組織を持ち上げ、注射器を使用してアガロースをカヌラを通して手動で送達し、毎秒0.3ミリリットル以下にする。肺組織が組織を過剰に膨らませることなく完全に満たされたら、すぐにカヌラを取り除き、気管支をクランプする。

アガロース凝固を容易にするために摂氏4度で培養培地に組織を沈め、さらに気管支開口部に対してアガロース充填手順を繰り返す。次に、アガロースで満たされた肺組織切片をスライスするまで摂氏4度培地で保存する。精密切断肺スライスの場合、細胞培養皿の底部にピンセットを軽く押しても崩壊しない、肺組織内の固体アガロース充填領域を特定する。

片側がまだ胸膜で覆われている固形充填領域の1〜1.5立方センチメートルブロックを物品切りし、シアノクリレート接着剤を使用して各組織ブロックの複数側をビブラートホルダーに取り付けます。長い組織ブロックを通して全体をスライスし、組織のわずか2〜3ミロメーターがスライスされていないままになるまで。鉗子を使用して、各500マイクロメートルのセクションを、栽培培地を含む12ウェルプレートの1つの井戸に移し、得られる。

すべての組織が切り離されたら、各井戸から個々の10センチメートルの培養皿にサンプルを移し、4ミリメートルの生検パンチャーを精密カット肺スライスの上面に直交して配置する。次いで、パンチャーを時計回りおよび反時計回りに移動させ、肺試料の組織パンチを得る。各パンチを96ウェルプレートの個々のウェルに新鮮な細胞培養培地に入れる。

すべての組織パンチが得られたら、最大5日間、細胞培養インキュベーターにプレートを置く。ヒト3D肺組織培養における免疫蛍光を用いた細胞核におけるフィブロネクチンの免疫標識は、保存された肺胞構造ex vivoのイメージングを可能にする。48時間の前繊維性サイトカインカクテルでヒト精密カット肺スライスパンチの治療は、線維症関連の細胞外マトリックス成分、コラーゲンタイプOne、およびフィブロネクチン遺伝子の有意な誘導を含むヒト肺3D組織培養における線維化のような変化をもたらす。

さらに、間葉マーカービメンチンのタンパク質レベルは、3D肺組織培養パンチの治療後、4人に3人の患者で調節される。この手順に従って、定量的リアルタイムPCRによるRNA分析、またはウェスタンブロッティングによるタンパク質分析などの他の方法を、組織内でそれぞれ遺伝子およびタンパク質発現を評価するために行うことができる。開発後、この技術は、実験性肺生物学の分野での研究、肺生物学の外植、ならびにヒト組織サンプルにおける毒物学的および薬理学的研究の道を開いた。

生きているヒト組織は感染する可能性があり、この手順を実行している間は、個人保護具や適切な組織貯蔵、輸送、廃棄物の取り扱いなどの予防措置を常に講じるべきであることを覚えておいてください