この技術により、短期間で操作をほとんどまたはまったく行なうだけで、密度のみに基づいて様々なプロセスを経て様々な細胞タイプと細胞を分離することが可能になります。この方法の主な利点は、それが最小限の侵襲的な、少量を必要とし、高速な結果を提供し、古典的な読み出しに依存せず、専門の人員が必要とされないことです。この技術は、例えば貧血や敗血症などの複数の疾患を検出するために適用することができる。
1回クリックランシング装置を使用して、アカゲサス因子陽性血液ドナーの指を刺し、1ミリリットルのDPBSで10マイクロリットルの血液を採取する。アカゲサス因子陽性細胞の1ミリリットルの懸濁液に1マイクロリットルの蛍光色素を加えて、細胞膜を蛍光染色し、37°Cで15分間インキュベートします。ペレットは、Gを5,600回Gで15秒間回転させて、1ミリリットルのDPBSを用いてペレットを3回洗浄した。
カルシウムとマグネシウムで1ミリリットルのHBSSでペレットを再懸濁します。ワンクリックランシングデバイスを使用して、アカゲサス因子陰性血液ドナーの指を刺し、2マイクロリットルの血液を収集します。ビーズのみを含む実験チューブを調製するには、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSの174マイクロリットル、IgGコントロールビーズの1マイクロリットル、1ミリリットル密度あたり1.2グラムの重いビーズの1マイクロリットル、500ミリモルガドリニウムの24マイクロリットルを追加します。
IgGを含む実験用制御チューブを調製するには、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSの172マイクロリットル、IgGコントロールビーズの1マイクロリットル、重いビーズの1マイクロリットル、アカゲサス因子陰性血液の1マイクロリットル、染色されたアカゲザル因子陽性血液懸濁液の1マイクロリットル、および500ミリモルガドリニウムの24マイクロリットルを加える。サンプル実験管を調製するには、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSの172マイクロリットル、抗RhDコーティングビーズの1マイクロリットル、重いビーズの1マイクロリットル、アカゲザル因子陰性血液の1マイクロリットル、染色されたアカゲザル因子陽性血液懸濁液の1マイクロリットル、および500ミリモルガドリニウムの24マイクロリットルを加えます。磁気浮上装置をセットアップします。
そして、チューブが満たされるまで、サンプルの50マイクロリットルをキャピラリーチューブに積み込みます。毛細管の端部を毛細管シーラントで密封し、気泡がないことを確認します。上と下の磁石の間のキャピラリーホルダーにキャピラリーチューブを置き、最適な視聴のためにステージとフォーカスを調整します。
細胞とビーズが磁気平衡位置に落ち着くまで約5~20分待ちます。このプロトコルを用いて、血液細胞は、磁気浮上装置を用いて浮上高さに応じて分離した。密度の高さとサイズの参照を提供するために、低密度および高密度のビーズが使用されました。
多形核細胞を21ミリモルガドリニウムイオン濃度で赤血球の上方に浮上した。古い血液細胞は、60ミリモルガドリニウムイオン濃度で浮上した。赤血球、多形核細胞、リンパ球は、その固有の密度に基づいて40ミリモルガドリニウムイオン濃度で分離した。
IgGおよび抗RhD抗体被覆ビーズを用いて赤血球上でアゲージ因子抗原を検出した。IgG対照試料ではビーズ赤細胞複合体は生成されなかったが、アキサス因子陽性ビーズによって捕捉された蛍光染色された赤血球が検出された。抗RhBとアカゲウス因子陽性細胞との結合により、非結合ビーズと陰性赤血球の間欠密度で中心にビーズ細胞複合体が作成された。
また、発光蛍光を観察することによって複合体形成を確認した。Cr1およびCD47用の抗体でコーティングされた高密度ビーズと低密度ビーズの間に形成されたBビーズ複合体は、細胞外小胞由来の赤血球の存在を示す。気泡を導入せずに毛細血管をキャッピングすることは最も困難なステップであり、練習が必要です。
この方法は、特に赤血球病に焦点を当てた血液学の洞察を提供することができます。
