ここで説明するプロトコルは、トランスジェニック蚊の性能と小さな実験室ケージ試験における野生型の比較を評価するのに適しています。小さいケージ試験はマラリアの除去のための新しい技術の実施を満たすのに役立つ経験的価値を提供するために重要である。ケージ試験は他の実験計画に適応することができ、欲望トランス遺伝子の脅威のダイナミクスを評価するのに適しています。
導入トランスジェニック個体に続く。3 つの 0.216 立方メートルケージを三重に設定して、実験の初期段階を開始します。そして、3週間にわたって各ケージに60秒の第二の野生型の幼虫を追加します。
毎週、各ケージ内の成体女性に、血液の食事源として麻酔マウスを提供する。そして、血液の食事の3日後に卵子容器。毎週各ケージから卵を孵化させます。
第4週から8週目まで、60匹のセカンドインスターL2幼虫を無作為に選択して、それぞれのケージに戻ります。第 9 週では、トリクリケータのセットをコントロールとして 1 セット、必要なリリース比ごとに 1 セットをランダムに割り当てます。毎週コントロールケージに30人の男性と30人の女性を持つ60匹の野生のタイプの子犬を追加します。
毎週60個の野生型の子犬と共に30個のトランスジェニックオスの子犬を加えることによって、それぞれのケージに1対1の比率を維持する。1〜0.1の比率では、60野生型の子犬と一緒に毎週300人のトランスジェニックオスの子犬をそれぞれのケージに加えます。ケージに蚊の子犬を加え、毎週血液の食事と孵化卵を提供することを繰り返します。
スクリーニングのために各ケージから合計300の幼虫を無作為に選び出す。幼虫およびパパル段階で蛍光性優勢マーカーの発現のための蛍光フィルターを用いて、立体顕微鏡で幼虫をスクリーニングします。結果の子犬の性別をスコア。
遺伝子駆動実験では、蚊を安全な昆虫に入れ、定期的な監視を伴う標準的な操作手順に従うことによって、バリア戦略を採用しています。各所望のトランスジェニックから野生型の男性の放出比に対して、2組の3重0.216立方メートルケージを備えたケージを用意します。1対1の男性の放出比を達成するために、各複製ケージに120人のトランスジェニック男性、120匹の野生型の雄と雌を子犬の段階に加える。
各ケージ内の4〜7日齢の雌に麻酔マウスを使用して血液食事を提供します。幼虫の皿の中で卵を孵化させた後、各ケージからランダムに約240の最初のインスターL1幼虫を選択し、それぞれのケージに戻る前に子犬に飼育します。前に説明したように、眼マーカーと性表現型の幼虫を選択してスクリーニングする。
野生型の雄に対するトランスジェニックの各特定の放出比に対して、男性と女性の同数の3倍の0.005立方メートルケージのケージセットアップを組み立てます。人工給餌装置を用いて、2日連続で各ケージ内の4〜7日齢の女性に血液食事を提供する。2回目の血液ミールの3日後、卵子容器を追加し、3日後に容器を取り除きます。
すべての死者と生きている大人がセックスによってケージに残っているスコアリングした後、分子分析のためにマイナス80度で保存します。卵を孵化させ、200 L1幼虫を選び、幼虫を脇に置いて次世代の新しいケージを作り出します。その後、スクリーニングのために確保された各ケージから別の500頭の幼虫を無作為に選択します。
選択した200頭の幼虫を子犬に、500頭の幼虫をL4インスターステージに飼育します。200トレイから子犬を返して、新しいケージを装着します。スクリーンは、以前のように、眼マーカーと性表現型のために無作為に選択された幼虫。
代表的な分析では、異なる母集団置換ケージ試験プロトコルに対して、最もパフォーマンスの高い反復の予測型ダイナミクスが示されている。結果は、7世代にわたってDsRedマーカー表現型を有する幼虫の直線増加割合を示した。1対1の非ドライブリリースは、7世代以内に80%以上の導入導入に達しました。
遺伝子駆動プロトコルは、3〜4世代以内にこれを達成しました。したがって、遺伝子駆動システムの単一の放出が遺伝子導入のより効率的であることを検証する。観察の終わりに、遺伝子ドライブシステムにおけるトランスジーンの普及はほぼ完全に導入された。
離型率の人口の年齢構造、ケージサイズなどの重要なパラメータは、実験の目的や特定の目的によって異なります。生殖能力や胎児性などのフィットネスパラメータを評価するための実験が行えます。ケージ試験からのさらに経験的なデータは、集団力学の数学的モデルをパラメータ化するために使用することができます。
