Burada açıklanan protokol, transgenik sivrisinek performansını ve vahşi tip meslektaşlarıyla karşılaştırmaları küçük bir laboratuvar kafesi denemelerinde değerlendirmek için uygundur. Küçük kafes denemeleri, sıtma eliminasyonu için yeni teknolojilerin uygulanmasını doldurmaya yardımcı olacak ampirik değerler sağlamak için önemlidir. Kafes denemeleri diğer deneysel tasarımlara uyarlanabilir ve arzu trans-gen tehdidinin dinamiklerini değerlendirmek için uygundur.
Giriş transgenik bireyleri takip ederek. Üç taraflı üç 0.216 metreküp kafes kurarak deneyin ilk aşamasına başlayın. Ve art arda üç hafta boyunca her kafese 60 ikinci instar yabani tip larva ekleyerek.
Her hafta, her kafesteki yetişkin dişilere kan yemeği kaynağı olarak uyuşturularak fareler sağlayın. Ve kan yemeğinden üç gün sonra bir yumurtlama kabı. Her kafesten haftalık yumurta yumurtaları yumurtadan çıkar.
Dördüncü haftadan sekize kadar, kendi kafeslerine dönmek için rastgele 60 ikinci instar L2 larva seçin. Dokuzuncu haftada, rastgele bir dizi üç taraflı kafesi kontrol olarak ve istenen her serbest bırakma oranı için bir set atayın. Kontrol kafeslerine haftalık 30 erkek ve 30 dişi ile 60 yabani tip pupa ekleyin.
60 vahşi tip pupa ile birlikte 30 transgenik erkek pupa ekleyerek her ilgili kafeste bire bir oranını koruyun. Bir ila 0,1 oran için, ilgili her kafese haftalık 300 transgenik erkek pupa ve 60 yabani tip pupa ekleyin. Her hafta kan unu ve kuluçkalık yumurta sağlayarak kafese sivrisinek pupaları eklemeyi tekrarlayın.
Tarama için rastgele her kafesten toplam 300 larva seçin. Larva ve pupal aşamalarında floresan baskın belirtecin ifadesi için floresan filtreleri ile bir stereo mikroskop altında larvaları tarayın. Elde eden pupaların cinsiyetini puanla.
Gen tahriki deneyinde, sivrisinekleri güvenli bir böcek ilacı içinde tutarak ve düzenli izleme ile standart çalışma prosedürlerini izleyerek bir bariyer stratejisi uygulayın. İstenen her transgenik ila vahşi tip erkek salınım oranı için iki set triplikat 0.216 metreküp kafes ile kurulmuş bir kafes hazırlayın. Bire bir erkek salınım oranı elde etmek için, her bir çoğaltma kafesine pupa aşamasında 120 transgenik erkek, 120 vahşi tip erkek ve dişi ekleyin.
Her kafeste dört ila yedi günlük dişilere uyuşturularak bir kan unu sağlayın. Bir larva tepsisinde yumurtadan çıktıktan sonra, her kafesten rastgele yaklaşık 240 ilk başlangıç L1 larvasını seçin ve ilgili kafeslerine dönmeden önce pupalara geri koyun. Daha önce açıklandığı gibi göz işaretleyici ve cinsiyet fenotipi için larvaları seçin ve tarayın.
Transgeniklerin vahşi tip erkeklere her bir spesifik salınım oranı için eşit sayıda erkek ve dişi ile triplikat 0.005 metreküp kafeslerin bir kafes kurulumunu monte edin. Yapay bir besleme aparatı kullanarak, her kafesteki dört ila yedi günlük dişilere art arda iki günde kan yemeği sağlayın. İkinci kan yemeğinden üç gün sonra, bir yumurtlama kabı ekleyin ve üç gün sonra kapları çıkarın.
Kafeste kalan tüm ölüleri ve canlı yetişkinleri cinsiyete göre puanlama yaptıktan sonra, moleküler analiz için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Yumurtaları yumurtadan çıkar ve 200 L1 larvasını seç ve larvaları bir sonraki nesil için yeni kafesleri doldurmak için bir kenara koyun. Ardından tarama için ayrılmış her kafesten rastgele başka bir 500 larva seçin.
Seçilen 200 larvayı pupaya ve 500 larvayı L4 başlangıç aşamasına geri döndürün. Yeni kafesi doldurmak için 200 tepsiden pupayı iade edin. Daha önce olduğu gibi göz belirteci ve seks fenotipi için rastgele seçilen larvaları tarayın.
Temsili analizde, farklı popülasyon değiştirme kafesi deneme protokolleri için en iyi performans gösteren çoğaltmaların beklenen fenotip dinamikleri gösterilmiştir. Sonuçlar, yedi nesil boyunca DsRed marker fenotipli larvaların doğrusal artan oranını gösterdi. Bire bir sürücüsüz sürüm, yedi nesil içinde%80'den biraz daha fazla transgene tanıtımına ulaştı.
Gen tahrik protokolleri bunu üç ila dört nesil içinde başardı. Böylece, bir gen tahrik sisteminin tek bir sürümünün transgene tanıtımı için daha verimli olabileceğini doğrulamak. Gözlemin sonunda, transjenin yayılması gen tahrik sistemlerinde neredeyse tam bir girişe ulaşmıştı.
Salınım oranı popülasyon yaş yapısı, kafes büyüklüğü ve diğerleri gibi önemli parametreler deneyin amacına ve belirli amaçlara bağlı olarak değişecektir. Doğurganlık ve doğurganlık gibi fitness parametrelerini değerlendirmek için deneyler yapılabilir. Kafes denemelerinden daha ampirik veriler, nüfus dinamiklerinin matematiksel modellerini parametreleştirmek için kullanılabilir.
