ガンマ-デルタT細胞は、急性骨髄性白血病を含む多くの癌タイプに対して強力な細胞傷害活性を有する。しかし、血液中のガンマデルタT細胞の循環は、特に悪性腫瘍患者において比較的まれである。ドナー由来の注入は、X-vivoがガンマデルタT細胞を拡大し、白血病の再発を減少させ、急性骨髄性白血病患者の生存率を向上させることを約束している。
提案された方法は、ガンマデルタT細胞拡張を200,000倍以上に達成し、3つの簡単なステップで、高度に純粋なガンマデルタT細胞製品の治療関連用量に達する。したがって、IELを拡張に結び付け、磁気選別によるαベータT細胞枯渇、AAAPCによるバウンティ二次膨張。提案された方法は、急速に棚から使用することができる細胞の多数を作成することにより、癌や自己免疫疾患などの疾患のためのガンマデルタT細胞の有用性を拡大します。
このプロセスは、異なる濃縮方法を使用してガンマデルタ細胞を拡張し、トランスダクションなどの追加の操作を追加するように調整することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の細胞療法技術者であるLAで行われます。発泡性製品サンプルの溶出から始まり、カウンターフロー遠心分離装置上で、ハンクスバランス塩溶液の一次培地を用いて、1%ヒト血清アルブミンおよび生理食塩水またはDPBSの二次培地を用いる。
900倍Gの溶出遠心速度で、流量と時間に基づいて分数を収集します。分数2からサンプルを収集し、フローサイトメトリーによる無菌性試験、細胞数および細胞平定化を行います。分数2から、培養中の純粋なリンパ球分画を10倍の10倍の6番目の細胞に拡大し、ゾレドロン酸の1リットル当たり5マイクロモル、インターロイキン2のミリリットル当たり300単位を1リットルの閉鎖系バイオリアクターに展開する。
5%の二酸化炭素で、摂氏37度で7日間システムをインキュベートします。インキュベーション後、1リットル閉系バイオリアクターフラスコから細胞を収穫する。これを行うには、滅菌は、バイオリアクターの赤線に1リットルの転写パックを溶接し、適切な製薬ポンプを使用して細胞を移送パックに移す。
フローサイトメトリーによる使用済み中型滅菌、細胞数および細胞のフェノタイピングの試験用サンプルを取る。残りのサンプルから、5回10〜1ミリリットル当たり8番目の細胞で細胞を再懸濁し、0.5%HSAおよびビオチン化T細胞受容体を含むPBS-EDTA緩衝液において、αβ特異的抗体。そして、揺れで摂氏2〜8度で細胞をインキュベートします。
15分後、0.5 HSAと遠心分離機を含む600ミリリットルのPBS-EDTAバッファーで細胞を15分間、摂氏2~8度で15分間洗浄し、非結合抗体を除去します。次いで、細胞を1ミリリットル当たり約5倍10〜8番目の細胞、0.5%HSAおよび7.5ミリリットルの抗ビオチン特異的マイクロビーズのバイアルあたり7.5ミリリットルを含むPBS-EDTAバッファーで再懸濁した。先に説明したように、細胞を振盪してインキュベートし、細胞懸濁液を遠心する前に、結合していないマイクロビーズを除去する。
0.5%HSAのPBS-EDTAバッファー中の1ミリリットル当たり7番目の細胞に6回10回再懸濁する。転送パックバッグにそれらを収集します。楽器の指示に従ってスパイクします。
次に、臨床グレードの磁気細胞分離装置にチューブセットを取り付けます。PBS-EDTAバッファーを備えたパックと、セル製品を持つ転送パックを機器に入れます。アルファβT細胞の枯渇については、ソフトウェアで枯渇1.2プロトコルを選択します。
次に、細胞産物を遠心分離し、ガンマデルタT細胞を濃縮した標的画分を回収する。回収した細胞を培地中で再中断し、10%ヒトAB血清を補った。細胞数の生存率およびフローサイトメトリーのフェノタイピングポストの枯渇を行う。
1ミリリットル当たり6番目の細胞に約10倍の最終濃度に細胞を持って来ます。X線発生装置上で100グレーで、フラスコ当たり7番目の人工抗原提示細胞またはAAAPCに5回10回照射する。共培養を調製し、照射されたAAAAPCおよびガンマデルタT細胞を10の割合で配置することにより、1リットルの閉じた系バイオリアクターフラスコに。
1リットルの培養培地を用いて、10%ヒトAB血清を補充し、最大10フラスコをシードする。37°C、5%の二酸化炭素で培養を10日間インキュベートし、3~4日ごとに、ストリップ、グルコース、乳酸メーターを使用してグルコースと乳酸塩のレベルをスクリーニングします。グルコースレベルが1デシリットル当たり215ミリグラムに低下した場合は、フラスコの体積を200ミリリットルに減らします。
残りの200ミリリットルの培地中の細胞を混合し、アクリジンオレンジまたはヨウ化プロピジウム染色による細胞計数および生存率測定用の0.5ミリリットルのサンプルを除去する。細胞数が等しい場合、または10以上の9番目に、1つのフラスコの内容物を2つに分割し、各フラスコをAIM-V培地で1リットルまで満たし、10%ヒトAB血清を補う。細胞数が10〜9番目未満の場合は、新鮮な1リットルの培養培地で細胞を供給し、10%ヒトAB血清を添加し、フラスコをインキュベーターに戻す。
共培養で10日間の終わりに、バイオリアクターフラスコを一度に1つずつ収穫し、すべての細胞を適切なサイズの移送パックに引き込む。品質管理試料を取り出した後、室温で15分間Gの200〜500倍の細胞を遠心し、上清を捨てる。バランスのとれた結晶溶液の溶液で細胞を洗浄し、室温で15分間Gの200〜500倍で0.5%HSAを補う。
0.5%HSAのバランスのとれた結晶溶液の目標体積100〜300ミリリットルでそれらを再中断します。ポストカウンターフロー遠心分離画分から分離された細胞。2つは純粋なリンパ球集団を生み出し、95.80%のガンマデルタT細胞特異的増殖の優れた平均生存率を有し、ゾレドロン酸は溶出後のリンパ球画分に存在するナチュラルキラー細胞の初期割合に依存した。
ガンマデルタT細胞薬物物質の濃縮は、T細胞受容体αβ枯渇を有する一貫した。3つの健常ドナーから製造されたガンマデルタT細胞薬剤製品は、T細胞受容体α陽性T細胞の1%未満の放出基準を満たし、平均0.11%CD20陽性B細胞、および0.00%T細胞受容体α陽性T細胞を有する。最終生成物におけるナチュラルキラー細胞の平均割合は、35%未満の放出基準を満たす17.06%前後であり、細胞細胞量分析の流れは、薬物物質および薬物産物のアイデンティティ、純度およびプロセス不純物を特徴付けるために利用された。
第2の再拡張は、AAPCとガンマデルタT細胞薬物物質の共培養から達成され、すべての放出基準を満たすガンマデルタT細胞薬剤製品を生成した。T細胞集団を豊かにするパトンは、製品の膨張と特性に影響を与えます。濃縮プロセスを開始する前に、濃縮方法の十分な検討と調査が必要です。
