Гамма-дельта Т-клетки обладают мощной цитотоксической активностью против многих типов рака, включая острый миелоидный лейкоз. Однако циркулирующие гамма-дельта Т-клетки в крови относительно редки, особенно у пациентов со злокачественными новообразованиями. Инфузия донорских, X-vivo расширенных гамма-дельта-Т-клеток, обещает уменьшить рецидив лейкемии и улучшить выживаемость пациентов с острым миелоидным лейкозом.
Предлагаемый способ достигает более чем 200 000-кратного расширения гамма-дельта-Т-клеток, достигая терапевтически значимых доз высокочистого продукта гамма-дельта-Т-клеток в три простых этапа. Таким образом, лигирование IEL к расширению, истощение альфа-бета-Т-клеток путем магнитной сортировки и вторичное расширение баунти с помощью AAPCs. Предлагаемый метод расширяет полезность гамма-дельта-Т-клеток при таких заболеваниях, как рак и аутоиммунные заболевания, быстро создавая большое количество клеток, которые могут быть использованы с полки.
Этот процесс может быть адаптирован для расширения гамма-дельта-клеток с использованием различных методов обогащения и добавления дополнительных манипуляций, таких как трансдукция. Демонстрация процедуры будет проведена в Лос-Анджелесе, технолог клеточной терапии, три из моей лаборатории. Начинают с элюирования образца шипучего продукта на устройстве центрифугирования противоточного потока, используя первичную среду сбалансированного солевого раствора Хэнкса, с 1% сывороточного альбумина человека и вторичную среду солевого раствора или DPBS.
Со скоростью центрифугирования элюрации в 900 раз больше G, собирайте фракции на основе скорости потока и времени. Соберите образцы из фракции два для проведения тестирования на стерильность, количество клеток и фенотипирование клеток с помощью проточной цитометрии. От фракции второй расширить чистую лимфоцитарную фракцию клеток в культуре в 10 раз 10 до шестой клетки на сантиметр в квадрате, с пятью микромолями на литр золедроновой кислоты и 300 единицами на миллилитр интерлейкина-2 в одном литре закрытой системы биореактора.
Инкубируйте систему в течение семи дней при температуре 37 градусов по Цельсию, с 5% углекислого газа. После инкубации собирают клетки из однолитровой колбы закрытой системы биореактора. Для этого стерильно приварите литровый трансферный пакет к красной линии биореактора и используйте соответствующий фармацевтический насос для переноса клеток в трансферную упаковку.
Возьмите образцы для тестирования стерильности отработанной среды, количества клеток и фенотипирования клеток методом проточной цитометрии. Из оставшегося образца повторно приостанавливают клетки в пять раз по 10 до восьми клеток на миллилитр, в буфере PBS-EDTA, содержащем 0,5% HSA и биотинилированный рецептор Т-клеток, альфа-бета-специфическое антитело. И инкубировать клетки при температуре от двух до восьми градусов Цельсия с встряхиванием.
Через 15 минут промыть клетки 600 миллилитрами буфера PBS-EDTA, содержащего 0,5 HSA, и центрифугу в 200-500 раз G в течение 15 минут, при двух-восьми градусах Цельсия, чтобы удалить несвязанное антитело. Затем повторно приостанавливают клетки примерно в пять раз от 10 до восьми клеток на миллилитр, в буфере PBS-EDTA, содержащем 0,5% HSA и 7,5 миллилитра на флакон антибиотиновых специфических микрогранул. Как описано ранее, инкубируйте клетки с встряхиванием, прежде чем центрифугировать клеточную суспензию, чтобы удалить несвязанные микрошарики.
Повторно суспендировать шесть раз по 10 до седьмых клеток на миллилитр в буфере PBS-EDTA с 0,5% HSA. Соберите их в сумку для переноски. Поднимите его, когда получите инструкцию от инструмента.
Затем установите комплект трубок в устройство для разделения магнитных клеток клинического класса. Поместите упаковки с буфером PBS-EDTA и трансферный пакет с продуктом ячейки в прибор. Для истощения меченых альфа-бета-Т-клеток выберите протокол истощения 1.2 в программном обеспечении.
Затем центрифугируют клеточный продукт для сбора целевой фракции, обогащенной гамма-дельта-Т-клетками. Повторно приостановить собранные клетки в среде, дополненной 10% сывороткой AB человека. Выполняют подсчет жизнеспособности клеток и проточную цитометрию фенотипирование после истощения.
Доведите клетки до конечной концентрации примерно в один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр. Облучите пять раз от 10 до седьмого искусственного антигенпрезентирующего клетки или AAPC на колбу, при 100 серых на рентгеногенерирующем инструменте. Готовят ко-культуру, помещая облученные AAPC и Gamma-Delta T-клетки в соотношении 10 к одному, в один литр закрытых системных колб биореактора.
С помощью одного литра питательной среды, дополненной 10% сывороткой АВ человека, засевают до 10 колб. Инкубируйте культуру при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 10 дней, с скринингом уровня глюкозы и лактата каждые три-четыре дня с использованием полосок, глюкозы и лактатометра. Если уровень глюкозы падает до 215 миллиграммов на децилитр, уменьшите объем в колбе до 200 миллилитров.
Смешайте клетки в оставшихся 200 миллилитрах среды и удалите образец размером 0,5 миллилитра для подсчета клеток и измерения жизнеспособности путем окрашивания акридиновым апельсином или йодидом пропидия. Если количество клеток равно или больше 10 к девятому, разделите содержимое одной колбы на две и заполните каждую колбу до одного литра средой AIM-V, дополненной 10% сывороткой AB человека. Если количество клеток меньше 10 к девятому, кормите клетки свежим литром питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека, и верните колбы в инкубатор.
По истечении 10 дней в совместной культуре собирают колбы биореактора по одной и вытягивают все клетки в трансферную пачку соответствующего размера. После удаления образцов контроля качества центрифугируют ячейки в 200-500 раз G в течение 15 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант. Промыть клетки раствором сбалансированного кристаллоидного раствора, дополненного 0,5% HSA в 200 - 500 раз G в течение 15 минут при комнатной температуре.
Повторно суспендировать их в целевом объеме от 100 до 300 миллилитров сбалансированного кристаллоидного раствора с 0,5% HSA. Ячейки отделены от постпотоковой центрифугированной фракции. Два дали чистую популяцию лимфоцитов с отличной средней жизнеспособностью 95,80% Удельное расширение гамма-дельта Т-клеток с золедроновой кислотой зависело от начального процента естественных клеток-киллеров, присутствующих во фракции лимфоцитов после элютрирования.
Обогащение гамма-дельта Т-клеточного лекарственного вещества с истощением альфа-бета-рецептора Т-клеток было последовательным. Гамма-дельта-Т-клеточный лекарственный препарат, изготовленный из трех здоровых доноров, соответствовал критерию высвобождения менее 1% альфа-бета-положительных Т-клеток рецептора Т-клеток, в среднем 0,11% CD20 положительных В-клеток и 0,00% Т-клеточных рецепторов альфа-бета-положительных Т-клеток. Средний процент естественных клеток-киллеров в конечном продукте составил около 17,06%, что соответствовало критерию высвобождения менее 35% Окрашивание поверхности клеток и проточный цитометрический анализ, которые использовались для характеристики идентичности, чистоты и технологических примесей лекарственного вещества и лекарственного продукта.
Второе повторное расширение, достигнутое из совместной культуры AAPC и гамма-дельта Т-клеточного лекарственного вещества, привело к образованию лекарственного препарата гамма-дельта-Т-клеток, который соответствовал всем критериям высвобождения. Пафоны, которые обогащают популяцию Т-клеток, влияют на расширение и характеристики продукта. Необходимо достаточное рассмотрение и исследование методов обогащения до начала процесса их обогащения.
