감마 델타 T 세포는 급성 골수성 백혈병을 포함하여 많은 암 모형에 대하여 강력한 세포 독성 활동이 있습니다. 그러나, 혈액에 있는 감마 델타 T 세포를 순환하는 것은 악성종양을 가진 환자에서, 특히 희소합니다. 기증자 유래의 주입, X-vivo 확장 감마 델타 T 세포, 백혈병의 재발을 감소시키고, 급성 골수성 백혈병환자의 생존을 향상에 약속.
제안된 방법은 200배, 000배 감마 델타 T 세포 확장을 달성하여 세 가지 쉬운 단계로 매우 순수한 감마 델타 T 세포 제품의 치료적 관련 용량에 도달합니다. 따라서 Iel을 확장, 알파 베타 T 세포 고갈에 의해 자기 분류 및 AApC와 바운티 이차 확장을 결합합니다. 제안된 방법은 선반에서 사용할 수 있는 많은 세포를 빠르게 생성하여 암 및 자가면역 질환과 같은 질병에 대한 감마 델타 T 세포의 실용성을 확장한다.
이 프로세스는 다른 농축 방법을 사용하여 감마 델타 세포를 확장하고 변환과 같은 추가 조작을 추가하도록 조정할 수 있습니다. 절차를 보여주는 LA에서 리스 될 것입니다., 세포 치료 기술자, 내 실험실에서 세. 1%의 인간 혈청 알부민과 식염용 액의 보조 배지를 사용하여, 행크스 균형 소금 용액의 기본 매체를 사용하여, 카운터플로우 원심 분리 장치에 발포 제품 샘플의 용해로 시작합니다.
용액 원심분리 속도는 G900배로 유량과 시간에 따라 분수를 수집합니다. 분수 2에서 샘플을 수집하여 혈류 세포측정에 의한 멸균 테스트, 세포 수 및 세포 피노티핑을 수행합니다. 분2에서, 1리터 폐쇄 시스템 생물 반응기에서 인터류신-2의 리터당 5마이크로몰과 인터류키인-2의 밀리리터 당 300 단위로 배양세포의 순수 림프구 분획을 10배 10배 10번에서 6세포제곱미터로 확장한다.
이산화탄소는 섭씨 37도에서 7일간 시스템을 배양합니다. 인큐베이션 후, 하나의 리터 폐쇄 시스템 생물 반응기 플라스크에서 수확 세포. 이를 위해, 멸균은 1리터 이송 팩을 생물반응기의 레드 라인으로 용접하고, 적절한 제약 펌프를 사용하여 세포를 이송 팩으로 이송한다.
유동 세포측정에 의한 소비된 중간 불균, 세포 수 및 세포 피노티핑의 테스트를 위해 샘플을 채취하십시오. 나머지 시료로부터, 밀리리터당 8번째 세포로 5배에서 10회, PBS-EDTA 버퍼에서 0.5%HSA 및 바이오티니화 T 세포 수용체, 알파 베타 특이적 항체를 함유한다. 그리고 흔들어 2 ~ 8섭씨에서 세포를 배양.
15분 후, 0.5 HSA 및 원심분리기를 함유한 PBS-EDTA 버퍼 600밀리리터로 세포를 15분 동안 200~500회 G에서 2~8도의 반동항체를 제거한다. 이어서, 밀리리터당 8번째 세포에 약 5회 10회, PBS-EDTA 버퍼에서 0.5%HSA 및 항비오틴 특이적 마이크로비드의 바이알당 7.5 밀리리터를 함유하고 있다. 앞에서 설명한 바와 같이, 흔들리지 않는 마이크로비드를 제거하기 위해 세포 현탁액을 원심분리하기 전에, 흔들림으로 세포를 배양한다.
0.5%HSA를 가진 PBS-EDTA 버퍼에서 밀리리터당 7번째 세포에 6회 10회 다시 중단한다. 그들을 전송 팩 가방에 수집합니다. 악기의 지시에 따라 스파이크합니다.
다음으로, 임상 등급 자기 세포 분리 장치에 튜브 세트를 설치한다. PBS-EDTA 버퍼와 함께 팩을 배치하고 셀 제품이 있는 전송 팩을 기기에 넣습니다. 레이블이 지정된 알파 베타 T 셀의 고갈을 위해 소프트웨어에서 고갈 1.2 프로토콜을 선택합니다.
그런 다음, 감마 델타 T 세포로 농축된 표적 분획을 수집하기 위해 세포 생성물을 원심분리한다. 10%의 인간 AB 혈청으로 보충된 배지에서 수집된 세포를 다시 중단한다. 세포 수 생존력 과 유동 세포측정량 계고 후 고갈을 수행한다.
밀리리터당 6세포에 약 10회 의 최종 농도로 세포를 가져옵니다. 제7회 인공 항원 제시 세포 또는 플라스크당 AAPC에 5회 10회, X선 생성 기기의 100회색으로 조사한다. 조사된 AApCs 및 감마 델타 T 세포를 10의 비율로 배치하여 1리터 폐쇄 된 시스템 생물 반응기 플라스크에 공동 배양을 준비합니다.
1리터의 배양 매체로, 10%의 인간 AB 세럼으로 보충되어 최대 10개의 플라스크를 시드합니다. 10일 간 37도, 이산화탄소 5%로 배양하고, 스트립, 포도당, 젖산 미터를 사용하여 3~4일마다 포도당과 젖산 수치를 선별합니다. 포도당 수준이 데시리터 당 215 밀리그램으로 떨어지면 플라스크의 부피를 200 밀리리터로 줄입니다.
나머지 200밀리리터의 매체에 세포를 혼합하고, 아크리딘 오렌지 또는 요오드 스테닝에 의한 세포 계수 및 생존성 측정을 위한 0.5 밀리리터 샘플을 제거한다. 세포 수가 10대 9에 같거나 10개 이상인 경우, 플라스크 1개의 내용을 2개로 나누고 각 플라스크를 AIM-V 배지로 한 리터까지 채우고, 10%의 인간 AB 혈청으로 보충한다. 세포 수가 10에서 9번 미만인 경우, 10%의 인간 AB 혈청으로 보충된 신선한 1리터의 배양 배지로 세포를 공급하고 플라스크를 인큐베이터로 되돌려 보입니다.
공동 배양에서 10 일의 끝에서, 생물 반응기 플라스크한을 한 번에 하나씩 수확하고, 적절한 크기의 전송 팩으로 모든 세포를 당깁니다. 품질 관리 샘플을 제거한 후 실온에서 15분 동안 200~500회 G에서 세포를 원심분리하고 상복부을 폐기한다. 균형 잡힌 결정용액의 용액으로 셀을 세척하여 실온에서 15분 동안 200~500회 G로 0.5%HSA로 보충합니다.
0.5%의 HSA를 사용하여 균형 잡힌 결정형 용액의 100~300밀리리터의 목표 부피에서 다시 중단합니다. 포스트 카운터플로우 원심분리 분과 분리된 셀. 2개의 순수한 림프구 인구를 산출했습니다, 95.80%의 우수한 평균 생존가능성으로 감마 델타 T 세포 특정 확장, zoledronic 산은 용액 후 림프구 분획에 존재하는 천연 킬러 세포의 초기 비율에 의존합니다.
감마 델타 T 세포 약물 물질의 농축, T 세포 수용체 알파 베타 고갈과 일관성이 있었다. 3명의 건강한 기증자로부터 제조된 감마 델타 T 세포 약 제품은, T 세포 수용체 알파 양성 T 세포의 1% 미만의 방출 기준을 충족했으며, 평균 0.11%CD20 양성 B 세포, 및 0.00%T-cell 수용체 알파 베타 양성 T 세포를 가졌다. 최종 제품에서 천연 킬러 세포의 평균 백분율은 약 17.06%로 35% 미만의 세포 표면 염색 및 유동 세포 측정 분석을 충족시켰으며, 약물 물질 및 약물 제품의 정체성, 순도 및 공정 불순물을 특성화하는 데 활용되었다.
AAPC와 감마 델타 T 세포 약물 물질의 공동 배양에서 달성 된 두 번째 재 확장은 모든 릴리스 기준을 충족 감마 델타 T 세포 약물 제품을 생성했다. T 세포 인구를 풍요롭게 하는 병기는 제품의 확장과 특성에 영향을 미칩니다. 농축 과정을 개시하기 전에 농축 방법에 대한 충분한 고려와 조사가 필요합니다.
