As células Gamma-Delta T têm poderosa atividade citotóxica contra muitos tipos de câncer, incluindo leucemia mielóide aguda. No entanto, as células Gamma-Delta T circulantes em um sangue são relativamente raras, particularmente em pacientes com malignidades. A infusão de células T derivadas do doador, X-vivo expandiu as células Gamma-Delta T, prometem reduzir a recorrência da leucemia e melhorar a sobrevivência de pacientes com leucemia mielóide aguda.
O método proposto alcança uma expansão celular Gamma-Delta T de 200.000 vezes, atingindo doses terapeuticamente relevantes de um produto celular Gamma-Delta T altamente puro, em três passos fáceis. Assim, ligando um IEL à expansão, o esgotamento das células Alfa Beta T por classificação magnética e recompensa de expansão secundária com AAPCs. O método proposto expande a utilidade das células Gamma-Delta T para doenças como câncer e doenças autoimunes, criando rapidamente um grande número de células que podem ser usadas fora da prateleira.
Esse processo poderia ser adaptado para expandir as células Gama-Delta usando diferentes métodos de enriquecimento e adicionando manipulações adicionais, como a transdução. Demonstrando que o procedimento será lithed em Los Angeles, um tecnólogo de terapia celular, três do meu laboratório. Comece pela elutriação da amostra do produto de efervescência, no dispositivo de centrifugação de contrafluxo, utilizando um meio primário de solução de sal balanceado Hanks, com albumina de soro humano de 1% e o meio secundário de solução salina ou DPBS.
Com a velocidade de centrifugação de elutriação a 900 vezes G, colete frações com base na taxa de fluxo e no tempo. Colete as amostras da fração dois para realizar o teste de esterilidade, contagem de células e fenotipagem celular por citometria de fluxo. A partir da fração dois, expanda uma fração pura de linfócitos de células na cultura em 10 vezes 10 para a sexta células por centímetro quadrado, com cinco micromoles por litro de ácido zoledrônico e 300 unidades por mililitro de Interleukin-2 em um bioreator de sistema fechado de um litro.
Incubar o sistema por sete dias a 37 graus celsius, com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, as células de colheita do frasco bioreator do sistema fechado de um litro. Para isso, solde uma embalagem de transferência de um litro para a linha vermelha do bioreator, e use a bomba farmacêutica apropriada para transferir as células para o pacote de transferência.
Pegue as amostras para testes de esterilidade média gasta, contagem de células e fenotipagem celular por citometria de fluxo. Da amostra restante, suspenda as células em cinco vezes 10 a oitava células por mililitro, no buffer PBS-EDTA contendo 0,5% HSA e receptor de células T biotinitadas, anticorpo específico alfa beta. E incubar as células a dois a oito graus Celsius com tremor.
Após 15 minutos, lave as células com 600 mililitros de tampão PBS-EDTA contendo 0,5 HSA e centrífuga a 200 a 500 vezes G por 15 minutos, a dois a oito graus Celsius, para remover o anticorpo desvinculado. Em seguida, suspenda novamente as células em aproximadamente cinco vezes 10 a oitava células por mililitro, em tampão PBS-EDTA contendo 0,5% HSA e 7,5 mililitros por frasco de microesferas específicas anti-biotina. Como descrito anteriormente, incubar as células com agitação, antes de centrifugar a suspensão celular para remover as microesferas não ligadas.
Suspenda seis vezes 10 para a sétima célula por mililitro no buffer PBS-EDTA com 0,5% HSA. Colete-os em uma mala de transferência. Espetá-lo quando instruído pelo instrumento.
Em seguida, instale um conjunto de tubos no dispositivo de separação celular magnética de grau clínico. Coloque as embalagens com o tampão PBS-EDTA e o pacote de transferência com o produto celular no instrumento. Para o esgotamento das células alfa beta T rotuladas, selecione o protocolo de esgotamento 1.2 no software.
Em seguida, centrifugar o produto celular para coletar a fração alvo enriquecida com células Gamma-Delta T. Suspenda demais as células coletadas no meio, suplementadas com soro AB 10% humano. Realize uma viabilidade de contagem de células e fenotometria de fluxo pós esgotamento.
Leve as células a uma concentração final de aproximadamente uma vez 10 a 6 células por mililitro. Irradiar cinco vezes 10 para a sétima células que apresentam antígeno artificial ou AAPCs por frasco, a 100 cinzas no instrumento gerador de raios-X. Preparar uma co-cultura, colocando as células IMS irradiadas e Gamma-Delta T na proporção de 10 é para uma, em um litro de frascos bioreatores fechados do sistema.
Com um litro de meio de cultura, suplementado com soro AB 10% humano, semente até 10 frascos. Incubar a cultura a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono por 10 dias, com uma triagem dos níveis de glicose e lactato a cada três ou quatro dias usando tiras, glicose e um medidor de lactato. Se o nível de glicose cair para 215 miligramas por decilitro, reduza o volume no frasco para 200 mililitros.
Misture as células nos 200 mililitros restantes da mídia e remova uma amostra de 0,5 mililitro para contagem celular e medição de viabilidade por coloração de iodeto de laranja acrídina ou propídio. Se a contagem de células for igual, ou mais de 10 a nona, divida o conteúdo de um frasco em dois e encha cada frasco até um litro com meio AIM-V, suplementado com soro AB 10% humano. Se a contagem de células for inferior a 10 a nona, alimente as células com um litro fresco de meio de cultura, suplementado com soro AB 10% humano, e devolva os frascos à incubadora.
Ao final de 10 dias em co-cultura, colher os frascos bioreatores um de cada vez, e puxar todas as células para um pacote de transferência de tamanho apropriado. Depois de remover as amostras de controle de qualidade, centrifugar as células a 200 a 500 vezes G por 15 minutos em temperatura ambiente, e descartar o sobrenante. Lave as células em uma solução de solução cristalina equilibrada, suplementada com 0,5% HSA a 200 a 500 vezes G por 15 minutos em temperatura ambiente.
Suspendê-los em um volume-alvo de 100 a 300 mililitros de solução cristalina equilibrada com 0,5%HSA. As células separadas da fração de centrifugação pós-fluxo. Dois produziram uma população de linfócitos puros, com excelente viabilidade média de 95,80% A expansão específica das células Gamma-Delta T, com ácido zoledrônico, dependia da porcentagem inicial de células assassinas naturais presentes na fração de linfócitos após a elutriação.
O enriquecimento da substância gamma-delta t-cell drug, com receptor de células T alfa beta esgotamento foi consistente. O produto de células Gamma-Delta T fabricado a partir de três doadores saudáveis, atendeu ao critério de liberação de menos de 1% das células T beta positivas T do receptor de células T, com uma média de 0,11% CD20 células B positivas, e 0,00% células T-receptor alfa beta positivo T. O percentual médio de células assassinas naturais no produto final foi de cerca de 17,06%, o que atendeu ao critério de liberação de menos de 35% A coloração da superfície celular e a análise citométrica de fluxo, foram utilizadas para caracterizar a identidade, pureza e impurezas de processo da substância da droga e do produto medicamentoso.
A segunda re-expansão obtida a partir da co-cultura da substância medicamentosa célulaS Gamma-Delta T, gerou um produto de células T Gama-Delta que atendeu a todos os critérios de liberação. Pathons que enriquecem a população de células T impactam a expansão e características do produto. É necessária consideração e investigação suficientes dos métodos de enriquecimento, antes do início de seu processo de enriquecimento.
