Le cellule T Gamma-Delta hanno una potente attività citotossica contro molti tipi di cancro, tra cui la leucemia mieloide acuta. Tuttavia, le cellule T Gamma-Delta circolanti nel sangue sono relativamente rare, in particolare nei pazienti con tumori maligni. L'infusione di cellule T Gamma-Delta espanse X-vivo derivate da donatori, è promettente nel ridurre la recidiva della leucemia e migliorare la sopravvivenza dei pazienti con leucemia mieloide acuta.
Il metodo proposto raggiunge un'espansione delle cellule T Gamma-Delta superiore a 200.000 volte, raggiungendo dosi terapeuticamente rilevanti di un prodotto a base di cellule T Gamma-Delta altamente puro, in tre semplici passaggi. Quindi legare un IEL all'espansione, l'esaurimento delle cellule T alfa beta mediante selezione magnetica e l'espansione secondaria bounty con AAPC. Il metodo proposto espande l'utilità delle cellule T Gamma-Delta per malattie come il cancro e le malattie autoimmuni creando rapidamente un gran numero di cellule che possono essere utilizzate dallo scaffale.
Questo processo potrebbe essere adattato per espandere le cellule Gamma-Delta utilizzando diversi metodi di arricchimento e aggiungendo ulteriori manipolazioni come la trasduzione. La dimostrazione della procedura sarà tradita a LA, un tecnologo di terapia cellulare, tre del mio laboratorio. Iniziare con l'elutrazione del campione di prodotto a effervescenza, sul dispositivo di centrifugazione controcorrente, utilizzando un mezzo primario di soluzione salina bilanciata Hanks, con l'1% di albumina sierica umana e il mezzo secondario di soluzione salina o DPBS.
Con la velocità di centrifugazione di elutrazione a 900 volte G, raccogliere frazioni in base alla portata e al tempo. Raccogliere i campioni dalla frazione due per eseguire il test di sterilità, la conta cellulare e la fenotipizzazione cellulare mediante citometria a flusso. Dalla frazione due, espandere una frazione linfocitaria pura di cellule in coltura a 10 volte 10 alle sesti cellule per centimetro quadrato, con cinque micromoli per litro di acido zoledronico e 300 unità per millilitro di interleuchina-2 in un bioreattore a sistema chiuso da un litro.
Incubare il sistema per sette giorni a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule dal pallone del bioreattore a sistema chiuso da un litro. Per fare ciò, saldare sterilemente un pacco di trasferimento da un litro alla linea rossa del bioreattore e utilizzare la pompa farmaceutica appropriata per trasferire le cellule nella confezione di trasferimento.
Prelevare i campioni per il test della sterilità media esaurita, della conta cellulare e della fenotipizzazione cellulare mediante citometria a flusso. Dal campione rimanente, sospendere nuovamente le cellule a cinque volte 10 all'ottava cellula per millilitro, in tampone PBS-EDTA contenente lo 0,5% di HSA e recettore delle cellule T biotinilato, anticorpo alfa beta specifico. E incubare le cellule a due-otto gradi Celsius con agitazione.
Dopo 15 minuti, lavare le cellule con 600 millilitri di tampone PBS-EDTA contenente 0,5 HSA e centrifugare a 200-500 volte G per 15 minuti, da due a otto gradi Celsius, per rimuovere l'anticorpo non legato. Quindi, sospendere nuovamente le cellule a circa cinque volte 10-ottava cella per millilitro, in tampone PBS-EDTA contenente 0,5% HSA e 7,5 millilitri per fiala di microsfere specifiche anti-biotina. Come descritto in precedenza, incubare le cellule con agitazione, prima di centrifugare la sospensione cellulare per rimuovere le microsfere non legate.
Sospendere nuovamente sei volte 10 alla settima cella per millilitro nel tampone PBS-EDTA con 0,5% HSA. Raccoglieteli in un sacchetto di trasferimento. Spike quando istruito dallo strumento.
Quindi, installare un set di tubi nel dispositivo di separazione delle celle magnetiche di grado clinico. Introdurre nello strumento le confezioni con il tampone PBS-EDTA e la confezione di trasferimento con il prodotto cellulare. Per l'esaurimento delle cellule T alfa beta marcate, selezionare il protocollo di esaurimento 1.2 nel software.
Quindi, centrifugare il prodotto cellulare per raccogliere la frazione target arricchita con cellule T Gamma-Delta. Sospendere nuovamente le cellule raccolte nel mezzo, integrate con siero AB umano al 10%. Eseguire una vitalità del conteggio cellulare e fenotipizzazione della citometria a flusso dopo l'esaurimento.
Portare le cellule a una concentrazione finale di circa una volta 10 alla sesta cella per millilitro. Irradiare cinque volte 10 alla settima cellula che presenta l'antigene artificiale o AAPC per pallone, a 100 grigi sullo strumento di generazione dei raggi X. Preparare una co-coltura, posizionando le AAPC irradiate e le cellule T Gamma-Delta al rapporto di 10 è a uno, in palloni bioreattori a sistema chiuso da un litro.
Con un litro di terreno di coltura, integrato con siero AB umano al 10%, semina fino a 10 palloni. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 10 giorni, con uno screening dei livelli di glucosio e lattato ogni tre o quattro giorni utilizzando strisce, glucosio e un misuratore di lattato. Se il livello di glucosio scende a 215 milligrammi per decilitro, ridurre il volume nel matraccio a 200 millilitri.
Mescolare le cellule nei restanti 200 millilitri di media e rimuovere un campione di 0,5 millilitri per il conteggio delle cellule e la misurazione della vitalità mediante colorazione di arancia acridina o ioduro di propidio. Se la conta cellulare è uguale o superiore a 10 a nona, dividere il contenuto di un matraccio in due e riempire ciascun matraccio fino a un litro con un mezzo AIM-V, integrato con siero AB umano al 10%. Se il numero di cellule è inferiore a 10 al nono, nutrire le cellule con un terreno di coltura fresco di un litro, integrato con siero AB umano al 10% e restituire i palloni all'incubatrice.
Alla fine di 10 giorni in co-coltura, raccogliere i palloni del bioreattore uno alla volta e tirare tutte le cellule in un pacchetto di trasferimento di dimensioni appropriate. Dopo aver rimosso i campioni di controllo qualità, centrifugare le celle a 200-500 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Lavare le cellule in una soluzione di soluzione cristallina bilanciata, integrata con 0,5% HSA a 200-500 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente.
Risespensali in un volume target da 100 a 300 millilitri di soluzione cristallina bilanciata con 0,5% HSA. Le celle separate dalla frazione di centrifugazione post controcorrente. Due hanno prodotto una popolazione di linfociti puri, con un'eccellente vitalità media del 95,80% L'espansione specifica delle cellule T Gamma-Delta, con acido zoledronico dipendeva dalla percentuale iniziale di cellule natural killer presenti nella frazione linfocitaria dopo elutrazione.
L'arricchimento della sostanza farmaceutica gamma-delta delle cellule T, con l'esaurimento del recettore alfa beta delle cellule T, è stato coerente. Il prodotto farmaceutico a cellule T Gamma-Delta prodotto da tre donatori sani, ha soddisfatto il criterio di rilascio di meno dell'1% delle cellule T beta beta positive del recettore delle cellule T, con una media dello 0,11% di cellule B CD20 positive e dello 0,00% di cellule T beta beta positive del recettore delle cellule T. La percentuale media di cellule natural killer nel prodotto finale era di circa il 17,06% che soddisfaceva il criterio di rilascio di meno del 35% La colorazione della superficie cellulare e l'analisi citometrica a flusso, sono state utilizzate per caratterizzare l'identità, la purezza e le impurità di processo della sostanza farmacologica e del prodotto farmaceutico.
La seconda riespansione ottenuta dalla co-coltura della sostanza farmaceutica AAPC e Gamma-Delta T-cell, ha generato un prodotto farmaceutico Gamma-Delta T-cell che ha soddisfatto tutti i criteri di rilascio. I pathon che arricchiscono la popolazione di cellule T influenzano l'espansione e le caratteristiche del prodotto. È necessaria una considerazione e un'indagine sufficienti sui metodi di arricchimento, prima di iniziare il loro processo di arricchimento.
