フローサイトメトリーは、単一細胞のマルチパラメトリック解析を可能にする強力な技術です。数百万の細胞を分析することにより、初期および後期アポトーシスのバイオマーカーを正確かつ迅速に特定できます。複数の細胞分子を染色し、同時に検出します。
特に、ベンチトップフローサイトメトリーは、専門家ではないフローサイトメトリストによる分析と解釈を可能にします。手順を実演するのは、ビタミンDがんグループの大学院生であるEsther Zhouです。まず、5%CO2、摂氏37度の加湿CO2環境で細胞培養を増殖させます。
実験のために細胞を継代する前に、細胞培養が親フラスコ内で約70%コンフルエントであることを確認してください。フラスコから培地を取り出し、細胞を1X PBSで洗浄します。次に、細胞を剥離するために1ミリリットルのトリプシンを追加します。
細胞が剥離し始めたら、細胞をカウントする前に、10%ウシ胎児血清を添加した約5ミリリットルの新鮮な培養液を加えてトリプシンを中和します。6ウェル細胞培養プレート中の3ミリリットルの細胞培養培地中に1ミリリットル当たり15, 000細胞で細胞を播種する。培養プレートを5%CO2で摂氏37度で一晩インキュベートし、細胞をウェルの底に付着させます。
翌日、実験培養物を1ミリリットルあたり100ナノグラムのアクチノマイシンDで処理し、培地と溶媒コントロールをそれぞれ新鮮な培地とDMSOで24時間処理します。ウェルから培地を取り出し、使用済みの培地を15ミリリットルのチューブに集めます。細胞を1X PBSで洗浄します。
細胞を剥離するために500マイクロリットルのトリプシンを加える。1ミリリットルの培地を2〜3回静かにバックピペットで入れて、ウェルの底に付着したままの残りの細胞を機械的に取り除きます。ウェルからの溶液を15ミリリットルのチューブに加え、次に5ミリリットルの新鮮な培地を加えてトリプシンを中和します。
DNA結合色素を含む試薬450マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに入れてピペットで入れる。50マイクロリットルの細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに加える。チューブを室温で5分間インキュベートします。
フローサイトメトリーで細胞を列挙します。アポトーシスアッセイに進む前に、細胞培養培地ですべてのサンプルを1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の濃度に1倍に希釈します。アネキシンVを用いてホスファチジルセリンの外在化を検出するには、100マイクロリットルの細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに加える。
これに、蛍光共役アネキシンVと7-AAD試薬の1:1混合物100マイクロリットルを追加します。光から保護された室温で20分間インキュベートする。ミトコンドリア膜脱分極の解析には、まず細胞懸濁液100マイクロリットルを300倍Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
細胞を1ミリリットルの1X PBSに再懸濁します。各サンプルに100マイクロリットルのTMRE染色溶液を加え、穏やかなバックピペッティングで懸濁液を混合します。サンプルをきれいなアルミホイルで包み、光から保護し、摂氏37度の加湿CO2環境で細胞を20分間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、7-AAD作業溶液をサンプルに加えて混合します。活性化末端カスパーゼ-3および7を検出するには、まず、滅菌1X PBSでDMSOでDEVE結合DNA結合ペプチドを1:8の比率に希釈してカスパーゼ検出作業溶液を作ります。溶液を氷の上に保管するか、光から保護された摂氏2〜8度を加えます。
2マイクロリットルの7-AADストック溶液を148マイクロリットルの1X PBSに加えて、7-AAD作業溶液を作ります。溶液を氷上または2〜8°Cで、光から保護して保管してください。細胞懸濁液50マイクロリットルを300倍Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
細胞を50マイクロリットルの1X PBSに再懸濁し、続いて5マイクロリットルのカスパーゼ検出作業溶液に再懸濁し、十分に混合します。チューブのキャップを緩め、光から保護された摂氏37度の加湿CO2環境で30分間インキュベートします。各サンプルに150マイクロリットルの7-AAD作業溶液を加えて混合します。
光から保護された室温で5分間インキュベートする。二本鎖DNA切断および全DNA損傷の検出のために、まず50マイクロリットルの細胞懸濁液を300倍Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を500マイクロリットルの1X PBSに再懸濁し、500マイクロリットルのホルムアルデヒドベースの固定バッファーを加えて混合します。
サンプルを氷上で10分間インキュベートします。300倍Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞をマイクロ遠心チューブ内の90マイクロリットルの1X PBSに再懸濁します。
10マイクロリットルの抗体溶液をマイクロ遠心チューブに加えます。室温で暗所で30分間インキュベートします。100マイクロリットルの1X PBSを添加し、300倍で5分間遠心分離します G.上清を捨て、細胞を200マイクロリットルの1X PBSに再懸濁します。
サンプルをフローサイトメーターにロードする前に、ゆっくりとバックピペッティングしてサンプルを混合します。装置のシステムチェックキットを実行してフローサイトメーターの分析性能を検証し、すべてのチェックが完了して合格するまでサンプルの実行を続行しないでください。まず、ネガティブコントロールサンプルをフローサイトメーターにロードし、実行、設定の調整を選択して、機器がサンプルの吸引を開始し、検出されたイベントのリアルタイムプレビューを提供します。
ライブプレビューを使用して、蛍光と細胞サイズのしきい値を調整します。細胞集団の周囲に長方形のゲートを描画し、しきい値マーカーをドラッグして細胞の破片を除外し、[次へ]、[アポトーシス プロファイルの設定] を選択して続行します。象限マーカーをタップしてドラッグし、細胞集団を分離し、検出されたイベントをリアルタイムでプロットします。
これらのプロットを使用して、象限マーカーの適切な配置についてエンドユーザーをガイドします。[次へ]、[設定の確認]を選択して続行し、機器に設定の概要を表示します。設定を確認したら、 [次へ]、[設定の完了] の順に選択して、実験内のすべてのサンプルにこれらの設定を適用します。
最初のサンプルを静かにバックピペッティングして混合し、最初のサンプルをフローサイトメーターにロードします。[次へ] を選択し、サンプルに名前を付けて [実行] を選択し、システムがサンプルの実行を開始するようにします。必要に応じて、集録後にゲートまたは象限マーカーの微調整を実行します。
システムのファイル ブラウザーで調整が必要な実験を見つけ、実験を開きます。プロットのサムネイルプレビューをタップして拡大します。象限マーカーを調整するには、垂直線と水平線の交点をクリックしてマーカーをそのまま移動し、線をクリックしてハンドルをドラッグして、いずれかの線の角度を調整します。
セル ゲーティングを調整するには、[ゲート] タブをクリックし、ゲートの寸法を調整します。必要に応じてマーカーを調整し、チェック マーク アイコンを選択し、すべてのサンプルをマークして [承認] を選択して、実験内のすべてのサンプルにこれらの設定を適用します。三重検定を実行し、事後ボンフェローニ検定で分散分析を実行して、サンプルと対照の有意差を評価します。
細胞数と生存率の結果は、サンプル中の細胞の95.2%が生きていて、4.8%が死んでいることを示しました。細胞濃度は1ミリリットルあたり105細胞の5.90倍であることがわかった。アネキシンVおよび細胞死アッセイは、対照と比較して、1ミリリットル当たり100ナノグラムのアクチノマイシンDで処理されたSiHa細胞において、アポトーシス細胞の有意な増加を示した。
ミトコンドリア電気化学的膜貫通電位アッセイは、アクチノマイシン-D、培地対照、および溶媒対照の間の細胞健康プロファイルの有意な減少を示し、100ナノグラム/ミリリットルのアクチノマイシンDがSiHa細胞においてミトコンドリア脱分極を誘導することを示唆した。カスパーゼ-3および7アッセイは、対照と比較して、1ミリリットルあたり100ナノグラムのアクチノマイシンDで処理されたSiHa細胞において、末端カスパーゼの有意な活性化を示した。アクチノマイシンDは、DNA損傷マーカー、ATM、およびH2Aを有意に誘導しました。
SiHa細胞におけるXは、DNA損傷の有意な増加を示唆した。精度を高めるには、必ず全細胞集団を採取してください。また、メーカーが推奨する細胞濃度と染色時間を遵守してください。
染色されたサンプルを光から保護することで、光退色や蛍光色素を回避できます。フローサイトメトリーによるアポトーシスの生化学的分析は、顕微鏡法によって裏付けられるべきである。これにより、古典的なアポトーシスの形態学的特徴が特定されます。
特徴には、核凝縮、細胞膜ブレンド、アポトーシス小体、および核性核筋が含まれます。
