アポトーシス逆転細胞の本物の集団の分離は以前は問題となっており、アポトーシス逆転の結果に関する我々の理解を大幅に制限している。このプロトコルは、我々はアポトーシス逆転細胞のより純粋な集団を生成することができます。この技術の主な利点は、使用される材料や機器が広く異なる機関で利用可能であるということです。
この技術は、アポトーシスの逆転を受けた細胞の純粋な集団を単離するために容易に適用可能である。既に報告したように、正常細胞はアポトーシス逆転を受けることもでき、乳がん細胞とは別に、異なる化学細胞、ならびに正常細胞を開始することができ、様々なアポトーシス刺激を使用することができる。逆転セルはアポトーシスと高速ソートを経ているので、回復率は通常低いです。
より大きな開始細胞数は、最終収率を増加させるために組み換えである。まず、培養MCF-7、MDA-MB-231、開始するには、培養MCF-7、MDA-MB-231、およびT47D細胞をテキストプロトコルに従う。この後、PBSで細胞を2回洗浄し、0.05%のトリプシン-EDTAの0.05%のトリプシン-EDTAをMCF-7に2ミリリットル加え、 MDA-MB-231細胞と、MCF-7、およびMDA-MB-231細胞に、0.25%のトリプシン-EDTAの2ミリリットルおよび0.25%のトリプシン-EDTAの2ミリリットルをT47D細胞に対する。
T47D セルにします。5%の炭酸ガス細胞培養インキュベーターで、摂氏37度で5分間培養する。細胞がインキュベートしている間、トリプシン-EDTAによる過剰消化を防ぐために顕微鏡で細胞の剥離を確認してください。
細胞の90%以上が剥離したら、完成したRPMI培地を5ミリリットル加え、細胞層表面にピペットを数回加える。次いで、細胞を15ミリリットル円錐形チューブ、および遠心分離機に移す。上清を捨て、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にFACSバッファーを入れたペレットを再中断します。
次に、細胞をいくつかのチューブに分割します。チューブをもう一度遠心分離し、上清を捨てます。次に、希釈したFcブロックをサンプルに加えます。
再び遠心する前に、暗闇の中で氷の上のサンプルを20分間インキュベートします。この後、上清を捨てます。次に、ヒトCD44に対するフルオロクロム共役モノクローナル抗体、およびCD24、ヒトCD44、およびCD24に対して、それぞれ1〜40、および1〜10の希釈液を二重染色群に加える。
陽性コントロールには、陽性制御のためにCD44抗体を追加し、MDA-MB-231細胞にCD44抗体を追加し、MCF-7細胞にCD24抗体とCD24抗体をMCF-7細胞に加え、MCF-7細胞に対して1~40個の希釈液をそれぞれ1~10個ずつ加える。PerCP-Cy5.5マウスIgG2bカッパを追加し、追加PerCP-Cy5.5マウスIgG2bカッパ、CD44抗体の同位体制御として細胞に1〜40の比率で希釈。次いで、PEマウスIgG2aカッパを加え、次いで、PEマウスIgG2aカッパを加え、CD24抗体の同位体制御として細胞に対して1〜10の比率で希釈した。
暗闇の中で摂氏4度で30分間インキュベートします。次いで、サンプルを300gで遠心し、サンプルを300gで遠心し、摂氏4度で5分間遠心する。上清を捨て、ペレットをPBSの500マイクロリットルで2回洗浄する。
次に、前述のように遠心分離を繰り返す。0.5ミリリットルのPBSでペレットを再懸濁し、40マイクロメートルのナイロンメッシュを通して懸濁液を濾過します。次いで、蛍光活性化細胞選別機を介して懸濁液を実行する。
CD44陰性の細胞を収集し、1ミリリットルの回収培地を含む丸底管にCD24陽性マーカーを入れた。次いで、チューブを遠心分離し、上清を捨てる。次に、さらに培養用の新鮮な採取培地を含む培養皿に選別した乳房非幹細胞をプレートする。
まず、DMSOに1ミリモルスタウロスポリンを使用し、テキストプロトコルに従って培地で2.5マイクロモルススタウロスポリンを調製する。次に、細胞から培地を除去する。2ミリリットルのPBSで細胞を1回洗い、その後、10ミリリットルのスタウロスポリン培地をMSF-7細胞に6時間加え、アポトーシスを誘導し、細胞が70%コンフルエントである場合。
次に、DMSOで1ミリモルパクリタキセルを調製する。その後、12.5マイクロリットルを加え、1ミリモルパクリタキセルの12.5マイクロリットルをT47D細胞の完成培地に加え、15ミリリットルの円錐管で10ミリリットルの最終体積を構成します。培養液を細胞から取り出し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。
次いで、パクリタキセル培地を10時間細胞に加え、細胞が70%の合流に達したときにアポトーシスを誘導するために10時間アポトーシスを誘導する。この後、溶媒処理MCF-7群から培地を取り出し、2ミリリットルのPBSで洗浄する。次いで、10ミリリットルのDMSO培地を加え、スタウロスポリンの溶媒制御として0.25%DMSO培地の10ミリリットルを6時間加える。
溶媒処理T47D基から培地を取り出し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。次いで、10ミリリットルのDMSO培地を加え、10ミリリットルのDMSO培地を10時間、パクリタキセルの溶媒制御として10時間加えた。次に、細胞を染色し、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で20分間インキュベートします。
60倍の共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、処理した細胞の形態変化を観察する。アポトーシス誘導体と溶媒処理MCF-7およびT47D細胞と溶媒処理MCF-7およびT47D細胞の両方を暗闇の中で30分間、摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで染色する。蛍光活性化細胞選別機を用いて、1ミリリットルの回収培地を含む丸底管で誘導体処理群から陽性細胞を採取する。
そして、先に述べたようにチューブを遠心分離し、上清を捨てる。1ミリリットルの回収培地を用いたラウンドボトムチューブの溶媒処理群から陰性細胞を採取する。チューブを遠心分離し、上清を捨てます。
この後、新しい収集媒体で並べ替えられたセルを再中断します。細胞を12ウェル組織培養プレートに播種し、アポトーシス逆転のために7日間培養します。0.05%トリプシン-EDTAを用いて、逆MCF-7をインデューサーおよび溶媒処理群の両方で収穫する。
0.05パーセントトリプシン-EDTAと。次いで、T47D細胞を両方の誘導体で収穫し、その後、0.25%トリプシン-EDTAを有するインデューサーおよび溶媒処理群の両方でT47D細胞を収穫する。ヒトCD44およびCD24に対するフルオロクロム共役モノクローナル抗体で細胞を染色する。
細胞が染色されている間、先に示したようにアイソタイプコントロールを準備します。最後に、フローサイトメーター上で細胞を実行し、CD44陽性、およびCD24陰性マーカーを有する細胞の割合を検出する。このプロトコルでは、乳房非幹細胞細胞から乳房CSC様細胞への移行が観察された。
非幹細胞癌細胞の単離は、MCF-7細胞で最初に行われた。典型的な形態変化は、アポトーシス誘導体を添加した後に観察され、薬物離脱後に同様の形態を有するアポトーシスから細胞が回収された。空腔活性化細胞は、カスペース活性化のない細胞よりも高い蛍光度に基づいて標識され、選別された。
アポトーシス誘導プロセスの間、溶媒は事実手順、または溶媒自体が転移の原因であった可能性を排除するために使用した。アポトーシス誘導体処置群におけるカスペース活性化細胞は、5陽性およびPI陰性のネキシンであることが判明し、それらがアポトーシス細胞であることを示唆した。回収のためにアポトーシス細胞を採取して培養し、溶媒処理群と比較して、フローサイトメトリック解析は、逆の元乳房非幹細胞癌細胞集団中にCD44陽性およびCD24陰性象限に出現する細胞があることを示した。
ガリングは、フロー分析と細胞のソートにおいて重要であり、ラボで十分な制御を準備する必要があります。このインビトロアポトーシス逆転手順は純粋なアポトーシス癌細胞を単離するので、生体内腫瘍形成資産などの実験を行い、細胞の実際の逆の結果を理解することができる。この技術は、癌再発の原因に光を当て、したがって、癌患者における再発を潜在的に防止するために調査することができる。
バイオセーフ層の規制に従って細胞培養実験を行う際は、必ず適切に保護してください。
