ガスハイドレート形態及び圧力温度安定性に対する各種添加剤の効果を試験することができる。しかし、主な関心事は、生体分子がどのように相互作用し、その現場のガスハイドレートに影響を与えるかを見つけることです。このプロトコルの主な利点は、安全にセシル液滴に水和物シェルを再現できることです。
液滴ステージを平準化することは困難であり、液滴が不均一な段階でスライドするので練習が必要です。また、高圧可燃性ガスに関するスウェージロック接続と安全性に精通してください。新しいナットとフェルールセットを使用して、メタンシリンダーレギュレータをポンプに1つずつ4インチの銅パイプで接続します。
IVチューブの柔軟な先端を接着し、角度をカットし、カニューレの端に、サファイアウィンドウに向かって液滴を向けます。カニューレに1ミリリットルのシリンジを取り付け、必要な量の脱イオン水を引き込みます。ニードルバルブやサファイアウィンドウが取り付けられていない場合は、カニューレの端部を上部ボードに挿入し、ドロップレットを中央のステージに排出する練習をします。
M8ネジでサファイアウィンドウとワッシャーを取り付け直し、トッププレッシャセルバルブを取り付けます。加編みのステンレス製ホースを圧力ポンプから圧力セルに接続します。そして、ガスボンベから圧力セルへのすべての接続がタイトであることを再確認してください。
圧力セルの入口弁を開き、水槽内に圧力セルをセットします。次に、光ファイバー光源ケーブルを圧力セル照明ポートに挿入します。エタノールと水の50/50比で満たされた水族館では、溶液レベルが次の週に下がるように、さらにエタノールを加え、圧力セルの上部とレベルが光源の接続のすぐ下に収まるまで追加します。
冷却機をセル内で約0~3°Cに達する温度に設定し、コイルを循環させます。水槽表面の結露を防ぐために、水槽の前面への空気の流れをオンにします。データロガーソフトウェアで温度ログを開始します。
スキャン間隔を30秒に設定し、圧力セル内の温度が2°Cで安定するまで待ちます。カメラを配置したら、光源を約80%に切り、カメラソフトウェアを開きます。Live View では、カメラレンズをセルの内側のチャンバーに合わせ、光源を調整して最適なイメージングを行います。
1 秒のスキャン間隔で新しい温度ログを開始します。取り付けた場合は、圧力セルの上部ポートにある出口ニードルバルブを取り外します。カニューレに1ミリリットルのシリンジを取り付け、必要な量の脱イオン水を引き込みます。
トップボードにカニューレを挿入して、Live Viewモードでカメラソフトウェアにチップが表示されるまで挿入します。中央熱電対上の注射器から流体液滴を排出します。その後、針弁を再び取り付けます。
圧力セル内の液滴にカメラを焦点を合わせます。60秒ごとにタイムラプスイメージングを開始します。ラップトップで圧力トランスデューサソフトウェアを開きます。
1秒のスキャン間隔でチャートとデータログでデータの収集を開始し、液滴温度が0〜3°Cの間で安定するまで待ちます。ポンプとコントローラーの電源を入れます。圧力ポンプの入口弁を閉じます。
ポンプの出口弁と圧力セルのバルブを開きます。圧力ポンプコントローラで0を押してポンプ圧力を引き起下げ。圧力ポンプコントローラのポンプAを選択して、圧力を監視します。
メタンガス以外の液体がポンプに存在する場合は、圧力ポンプが空であることを確認してください。最大流量と定常流量を毎分100ミリリットルに設定し、実行を押してこれを行います。ポンプが空になるまで動かしたままにします。
ポンプ出口バルブを閉じ、ポンプ入口バルブを開きます。ガスボンベを開き、ガスボンベレギュレータを1,000キロパスカルに設定します。圧力ポンプコントローラのリフィルを押します。
ポンプが満杯で1,000キロパスカル付近になったら、ポンプ入口バルブとガスボンベを閉じます。ポンプ出口バルブをセルに少し開けます。圧力トランスデューサソフトウェアの圧力セル圧力を監視し、圧力セル内の温度が比較的低いために低下する可能性があります。
最大流量を 1 分あたり 10 ミリリットル、最大圧力を 5,000 キロパスカルに、圧力ポンプ コントローラの 1,000 キロパスカルに一定の圧力を設定します。[実行] を押します。1,000 キロパスカルに達したら、ポンプコントローラの停止を押し、ポンプの出口バルブを閉じます。
圧力セルの圧力を監視して、漏れが発生しないようにします。圧力が下がった場合は、液体漏れ検知器を使用して接続時に漏れを検出し、漏れたコンポーネントを慎重に締め付けます。セルが安定している場合は、ポンプ出口を開き、一定圧力を2,000,3,000,4,000,5,000キロパスカルに徐々に設定し、各設定後に停止を押して細胞安定性を監視する。
圧力が安定している場合は、ポンプ出口を閉じ、ガスが液滴に浸透するまで約12〜24時間待ちます。2~5秒ごとに画像を撮影するようにタイムラプスを切り替えます。水分補給殻がタイムラプスで見えるまで、細胞の上部にドライアイスを加えます。
ドライアイスがスライドする場合は、セルの上部にテープを貼り付けます。タイムラプス写真を通してメタンハイドレート形成の進行を2〜6時間観察する。ポンプ出口を開き、融解が発生したときに、2,000キロパスカルに一定圧を設定することにより、細胞を2,000キロパスカルに減圧します。
30分後、圧力セルを5,000キロパスカルに再加圧し、メモリ効果を観察します。水和物シェルが改革を開始し、シェルが30分から2時間形成されるようにするときに注意してください。ポンプ出口を開き、100キロパスカルに一定圧力を設定することによって、セルを減圧します。
圧力セルに残留圧力がある場合は、圧力セル上部バルブを1/16インチ開きます。圧力データと温度データを CSV ファイルとして保存します。上圧セルバルブを取り外し、注射器、カニューレ、またはIVチューブで液滴を抽出して液滴を除去します。
試験間の汚染の懸念がある場合は、テキスト原稿の指示に従ってください。ドライアイス強制水和物シェル形成には明らかな形態学的な違いがあり、水滴は滑らかな反射面からわずかな樹状表面を持つ不透明な水和物シェルに移行しました。タイプ1の不凍液タンパク質に1ミリリットル当たり100マイクログラムを添加すると、液滴に沿って隆起した縁部と液滴の上部から突起を誘導することによって、水和物形態を変化させた。
水和物殻が1時間発達した後、細胞は2メガパスカルに減圧され、P/T安定性曲線付近の温度が2〜5度低下した。発熱性水和物解離により、温度低下の開始時にタイムラプスイメージングを経て目視融解により水和物解離が確認された。無滴で、水和物殻を形成しなかった液滴を有する陰性制御は、減圧中の温度の低下を示さなかった。
各温度の頂点が以前に確立されたP/T安定性曲線を上回るため、これらの試験の頂点P/Tに基づいて回帰曲線を計算しました。このプロトコルを実行する際には、2 つのことを念頭に置いておく必要があります。1つは、加圧前にすべての接続が安全であることを確認し、2つは、サファイアウィンドウを取り付ける前に液滴を排出する練習をします。
このプロトコルに従って、ガス消費量を計算し、画像を分析して水和物シェルの厚さを計算し、形成された水和物の体積を決定することができます。
