3D単一分子トラッキングは、個々のタンパク質の細胞内局在および動作挙動を決定することができます。生きた細胞でタンパク質の動きを観察することは、そのネイティブ環境における結合パートナーとの相互作用に関する重要な洞察を提供します。ここで示す方法は、単一分子追跡データを分析して生体分子の拡散状態を解決するための一般的なフレームワークを提供する。
任意の形状のセル体積に限定された 2D および 3D の両方の軌道に適用できます。付属のテキストプロトコルに記載されているように、あらかじめ用意されたアガロースパッドに蛍光ビーズを付着した後、それを顕微鏡カバースリップに置き、カバースリップを顕微鏡サンプルホルダーに固定します。サンプルホルダーは、次いで反転蛍光顕微鏡に取り付けられます。
次に、顕微鏡のグラフィカルユーザーインターフェースを初期化し、ここでは、MATLABのカスタム書き込みソフトウェアを計測器制御に使用します。カメラソフトウェア HCImage ライブを初期化します。[カメラコントロール]セクションの[キャプチャ]タブで、露出時間を0.03秒に設定し、[Live]をクリックしてカメラのライブフィードを開始します。
GUI インターフェースの適切な「オープン・レーザー」ボタンをクリックして、レーザーのブロックを解除し、アガロース・パッドの蛍光ビーズを励起します。ライブストリームモードを使用して、カメラの蛍光放出を表示します。顕微鏡ステージの X 位置と Y 位置を調整するには、ユーザーインターフェイスのマイクロポジショニング ステージ セクションの下にある XY 位置矢印をクリックして、少なくとも 1 つの蛍光ビーズを視野の中央に配置します。
必要に応じて、矢印の下のドロップダウン ボックスをクリックして、ステップ サイズを変更します。次に、ナノポジショニングステージセクションの下にあるZ位置矢印をクリックして、顕微鏡ステージのZ位置を調整します。蛍光ビーズの二重らせん点拡散機能の向きを垂直に設定します。
この垂直方向は、Zキャリブレーションの開始点として定義されます。開始Z位置の上下30ステップを50ナノメートル単位でスキャンします。露出時間 0.03 秒を使用して、各ステップで 10 フレームを記録します。
自動データ収集を開始するには、[Zキャリブレーション]の下の[移動]をクリックします。遠心1ミリリットルの熱衝撃を受けたエルシニア・エンゴコリチカ培養を室温で3分間重力5,000倍で培養し、培養液を除去し、上清を捨てる。ペレットを1ミリリットルのM2G培地で3回洗います。
最終リンスの後、M2G培地の250マイクロリットルにペレット化細菌を再懸濁します。次に、受託者マーカーとして使用する蛍光ビーズを追加します。蛍光ビーズ溶液は、顕微鏡で見たときに視野ごとに1〜2個のビーズが存在するように添加する必要があります。
M2Gで作られた1.5〜2%のアガロースパッドに1.5〜2%のアガロースパッドに1.5マイクロリットルの凝集した細胞とプレートを分離するためにボルテックスで懸濁液をそっと混ぜ、その後、パッドを反転し、オゾンクリーニング顕微鏡カバースリップに置きます。浸漬油を顕微鏡の目的に加え、サンプルホルダーを顕微鏡のステージに置き、所定の位置に固定します。顕微鏡のカメラ、サンプルステージ、励起レーザーを制御するグラフィカルユーザーインターフェースを初期化し、カメラソフトウェアを初期化します。
[カメラコントロール]セクションの[キャプチャ]タブで、露出時間を0.025秒に設定し、[Live]をクリックしてカメラのライブフィードを開始します。マイクロポジショニングステージセクションの下にある XY 位置矢印をクリックして、サンプルの周りをスキャンし、細菌細胞の適切に密集した集団を持つ視野を見つけることで、顕微鏡ステージの X 位置と Y 位置を調整します。データのスループットを最大化するには、カバースリップのセル密度を、重なり合ったり、互いに接したりすることなく、できるだけ高くする必要があります。
視野には、データの取得中にステージシフトを測定できるように、少なくとも1つの蛍光ビーズを受託者マーカーとして含める必要があります。次に、蛍光ビーズの二重らせん点広がり機能ローブが垂直になるように、ナノポジショニングステージセクションの下のZ位置矢印をクリックして、顕微鏡ステージのZ位置を調整します。次に、[シーケンス] に移動して [スキャンの設定] を選択します。
フレーム数を 20,000 に変更します。次に、3つのドットでラベル付けされたボタンをクリックして保存先フォルダを選択します。最後に[開始]をクリックして、0.025秒の短い露出時間を使用して最大20,000のカメラフレームを収集します。
完了したら、グラフィカル ユーザー インターフェイスで適切な [レーザーを閉じる] ボタンをクリックして、レーザー照明をブロックします。その後、同じ露出時間を使用して暗い画像の200フレームを収集します。Thorlabs LEDの横にあるチェックボックスをオンにし、[ミラーアップの切り替え]をクリックします。
位相コントラスト経路でデータ取得ソフトウェアを初期化し、[ライブディスプレイの開始/停止]ボタンを押してカメラからのライブフィードを表示します。次に、[キャプチャして移動] をクリックして画像を保存し、現在の視野内のセルの位相コントラスト 画像を収集します。受託マーカーとして使用するために蛍光ビーズを適合します。
テキスト プロトコルで説明されているように、テンプレートのしきい値を使用して、すべてのローカリゼーションとすべてのカメラ フレームを検索して適合させます。Easy-DHPSF GUI の「DHPSF SM をローカライズ」セクションで、「実行」をクリックして単一分子信号に適合させ、次のポップアップ・ウィンドウで「OK」をクリックしてデフォルト設定を維持します。ソフトウェアは、二重らせん点広がり関数に似た単一分子蛍光信号を見つけ、二重ガウスモデルを使用してそれらを適合させようとします。
スクリプトが実行されると、ユーザーは生画像データの表示と、正常に適合した単一分子信号の再構築された画像を見ることができます。MATLABでカスタム作成されたソフトウェアを使用して、ポップアップウィンドウで、単一分子ローカリゼーションデータとセルアウトラインの両方で同じ5つのセルのセル極を大まかに推定してクリックすることで、手動で5つのコントロールポイントペアを選択します。ローカライズが 10 未満のセルを削除し、部分的に視野外に配置されているセルを削除してから、セルのアウトラインの内側をクリックして、ポップアップ ウィンドウ内の不要なセルを削除します。
最後に、セルのアウトラインの境界内にあるローカリゼーションをそのセルに割り当てます。セルのアウトライン内にないローカリゼーションを破棄します。このプロトコルをうまく適用するために重要な要因は、単一分子シグナルが互いに十分に分離されるようにすることです。
細胞内に同時に複数の蛍光分子がある場合、局在化は別の分子の軌道に誤って割り当てられる可能性があります。このプロトコルは、2つ以上の局在が同時に同じセル内に存在する任意の軌道を破棄することによって、リンクの問題を排除するために働く。したがって、単一分子信号が高密度すぎると、大量のデータが処理時に自動的に破棄されます。
蛍光標識融合タンパク質の発現レベルに応じて、細胞当たり約200~3,000の局在を生成できます。これらの局在化は、10から150の軌道の間で得ることができます。十分にサンプリングされた分布を生成するには、多数の軌道が必要です。
ここに示されているのは、Yersiniaエンゴコリチカ型3型分泌タンパク質YscQの80,000近くの単一分子軌道に対する見かけの拡散係数のヒストグラムです。YscQは、黒色で示される分布によって示されるように、拡散しない分子の一部を生じる膜埋め込みインジェクティソームに結合する。残りのYscQ分子は、細胞質ゾルに自由に拡散します。
ここで説明する方法の間に、少なくとも3つの異なる拡散状態に非結合YscQ分子が存在すると判断される。この結論は、既知の拡散係数を持つ模擬分布のライブラリを持つ見かけの拡散係数の分布を適合させることによって達成された。複数の拡散状態を解決しようとする場合、見かけの拡散係数分布が非常によくサンプリングされるように、数千個の単一分子軌道を収集する必要があります。
単一分子追跡は、野生型細胞または遺伝的欠失変異体において、分子結合パートナーが存在する場合にのみ特定の拡散状態が現れるかどうかを判断するために行うことができる。3D単一分子追跡を用いて細胞質タンパク質とタンパク質複合体の拡散状態を解明することで、生細胞におけるオリゴマータンパク質複合体の形成場所、時期、方法を決定できます。高出力レーザー源と生きたヒト病原体の操作は、非常に危険です。
適切なレーザー安全およびバイオセーフティプロトコルは、常に従う必要があります。
