このプロトコルは、個々のマクロピノソームの内腔内の様々なプロセスと生化学的パラメータのリアルタイム評価を可能にする。これらの方法は、マクロピノサイトーシスの細胞生物学における創薬に使用することができる。このプロトコルは、細胞レベルとオルガネラレベルの両方で不均一性を明らかにする利点を提供する。
アッセイシードRaw264.7細胞の1日前に、1ウェルあたり100マイクロリットルの細胞の力に対して、黒い側面を持つガラス底96ウェルプレートに5倍の10の密度で。アッセイの日に、ウェルが少なくとも70%コンフルエントであるかどうかを確認します。その後、37°Cで予熱HBSSの100マイクロリットルですべての井戸を洗います。
次に、70キロダルトンデキストランと0.025ミリグラムのフルオレセインを各ウェルに70キロダルトンデキストランとラベル付けした1ミリリットル当たり0.025ミリグラムを含むHBSSの100マイクロリットルを加え、15分間摂氏37度で細胞をインキュベートします。インキュベートが完了したら、インキュベーターからプレートを取り出し、HBSSを100マイクロリットルで細胞を6回洗浄します。最後の洗浄の後、細胞に100マイクロリットルの前温めのHBSSを加え、加熱されたステージとチャンバーを持つ顕微鏡にプレートを置きます。
必要に応じてTMRとフルオレセインの励起および発光パラメータを調整した後、各ウェル間の2つのフルオロフォアの間で交互に各ウェルから画像を取得します。最初の取得後、すべてのウェルがプレート全体に焦点を合わせ続けているかどうかを確認し、所望の時間の1〜15分間隔で各ウェルの画像を取得します。画像取得中に、必要に応じて10モル塩酸、または10モル水酸化カリウムを使用して、25ミリモルHEPESで緩衝されたカリウムリッチ溶液の50ミリリットルのアリコートのpHを7.5に調整します。
次に、25ミリモルMESで緩衝されたカリウムリッチ溶液の350ミリリットルのアリコートのpHをpH 6.5、pH 5.5およびpH 5.0に調整します。画像の取得が完了したら、細胞を含む96ウェルプレートからHBSSを取り出し、カリウムリッチ溶液をpH 7.5に添加します。その後、1 ミリリットルあたり 10 マイクログラムの最終濃度でニジェリシンを追加します。.
プレートを顕微鏡に戻し、前に示したように取得設定を使用して各ウェルの画像を取得します。マクロピノソーム内の酸化事象を測定するには、前述のように、アッセイの前日に96ウェルプレートにRAW264.7細胞をシードします。その後、アッセイの日に37°Cに予熱したHBSSの100マイクロリットルですべての井戸を洗います。
次に、70キロダルトンデキストランと0.025ミリグラムのTMR 1ミリリットルを含むHBSSの100マイクロリットルを加え、各ウェルに70キロダルトンデキストランとラベル付けされたH2DCFDAのミリリットル当たり0.025ミリグラムを加え、37°Cで細胞を15分間インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出した後、HBSSの100マイクロリットルで細胞を6回洗浄する。最後の洗浄後、HBSSを100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、顕微鏡にプレートを置きます。
必要に応じてTMRおよびH2DCFDAの励起および放出パラメータを調整した後、前に示したように、各ウェルの画像を1〜15分間隔で取得します。マクロピノソーム内のタンパク質消化を測定するために、前述のように、アッセイの前日にRAW264.7細胞をシードします。その後、アッセイの日に37°Cで予熱したHBSSの100マイクロリットルですべての井戸を洗います。
次に、100マイクロリットルのHBSSを追加し、TMRのミリリットル当たり0.025ミリグラムを含み、各ウェルに1ミリリットルのBODIPYラベル付きオアルブミンあたり0.2ミリグラムで70キロダルトンデキストランとラベル付けしました。その後、15分間摂氏37度でプレートをインキュベートします。インキュベーターから細胞を取り出した後、HBSSの100マイクロリットルでそれらを6回洗浄します。
最後の洗浄の後、各ウェルにHBSSの100マイクロリットルを追加し、顕微鏡の上にプレートを置きます。必要に応じてTMRとBODIPYの励起および放出パラメータを調整した後、前に示したように、各ウェルの画像を1〜15分間隔で取得します。マクロピノソームにおけるpH、酸化事象またはタンパク質分解を測定する場合、使用する細胞の種類によって変化するデキストランローディング相に対応する一定期間の酸性化のダイナミクスを測定することはできません。
マクロピノソームpHを測定する場合、フルオレセイン対TMR比は徐々に小さくなり、取得後15分以内に高原化します。この高原は約5のpHに相当し、これはリソソームのpHとほぼ一致する。各集録の終了時に、In situキャリブレーションが実行されます。
蛍光透光度は、pH 7.5のキャリブレーションバッファ内で最大であり、キャリブレーションバッファがより酸性になるにつれて徐々に小さくなるはずです。これにより、キャリブレーションカーブの生成が可能になります。マクロピノソーム内の酸化事象を測定する場合、H2DCFDAとTMRの比率は徐々に大きくなり、活性化されたRAW264.7細胞では最初の20〜30分以内に高原になる可能性が高くなります。
マクロピノソームタンパク質消化を測定する場合、徐々に強いフルオレセインシグナルは、オボアルブミンが消化されると解放されます。RAW264.7細胞において、消化されたBODIPY標識されたオボアルブミンから遊離した蛍光の増加は、最初の30分以内に高原化する。恒常性におけるこの新たな役割を持ち、癌病理との関連性が新たに発見されたことで、現在、ルネサンスのマクロピノサイトーシス研究が進行中である。
これらの研究分野に対するマクロピノサイトーシスの寄与を探るためのツールボックスに提供されるこれらの方法。
