このプロトコルを使用すると、高品質の細菌細胞ライセートは、広く利用可能な一般的な実験室装置のみを使用して製造することができ、ほとんどの研究者が無細胞遺伝子発現を容易に利用できるようにします。プログラムの細胞の自己起液を凍結融解または凍結乾燥サイクルと組み合わせることで、無細胞遺伝子発現のための細菌のライセートを迅速に生産するための実用的で手間と費用対効果の高いアプローチを作成できます。接種ループを使用して、自己融解大腸菌株の細胞を1ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラムを含むLB寒天プレートにストリークし、一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。
翌日、ピペットチップを使用して、寒天プレートから単一のコロニーを選び、アンピシリンを含むLB培地を含む培養管に加える。このスターターカルチャーを一晩で摂氏37度で育ててください。翌日、400マイクロリットルのスターター培養液を1リットルのエルレンマイヤーフラスコに加え、2xYTPG培地の400ミリリットルを含み、ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラムを添加する。
300 RPMで振ると37°Cで培養します。分光光度計と1センチメートルのパス長を持つ光学キュベットを使用して、600ナノメートルで培養物の光学密度を定期的に測定します。光学密度が1を超えた場合、測定前に培養物を5倍希釈し、測定が典型的な実験室分光光度計の線形範囲内に留まることを確認します。
5倍希釈培養の光学濃度が0.3に達したら、培養器からフラスコを取り出し、リセートの調製に進みます。ライセートを調製するために、1,800xgで遠心分離により細胞を室温で15分間収穫する。上清を注ぎ、ピペットを使用して残りの液体を取り除きます。
45ミリリットルの冷たいS30Aバッファーをペレットに加え、渦によってペレットを再懸濁する。次いで、細胞をチューブに移す前に、空の50ミリリットル遠心管を秤量する。再び細胞を遠心分離し、上清を捨てます。
ピペットを使用して残りの上清を吸引する。チューブの重量を再測定し、表示された重量から空のチューブの重量を差し引いてペレットの重量を得ます。細胞ペレットの1ミリグラムごとに, 2 ミリモルジチオトレイトールを補った冷たい S30A バッファーの 2 マイクロリットルを追加します。.
次に、激しい渦を流して細胞を再懸濁する。次に、ペレットが完全に凍結するまでマイナス20度またはマイナス80度の冷凍庫に入れて細胞を凍結し、室温の水浴で細胞を解凍し、2〜3分間激しく渦を抜けます。300 RPMで揺れで45分間摂氏37度で細胞をインキュベートし、透明遠心管で30,000 x gの遠心分離機で45分摂氏4度で重い細胞の破片のサンプルを取り除きます。
慎重にペレットを乱さないよう注意して、ピペットで新しいチューブに上清を転送します。移管された上清がペレットからの材料で汚染されている場合は、遠心分離を繰り返します。上清を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。
そして、遠心分離機は21、000 x gまたは5分間卓上遠心分離機の最高速度でもう一度。アリコートクリアされた自動調整は、所望のボリュームにし、使用するまでマイナス80度で保存します。自己駆処理を用いた無細胞遺伝子発現の場合、8マイクロリットルの自己自動処理物と8.9マイクロリットルのプレミックスを氷上に混合します。
DNAを8ナノモルの最終濃度に加え、他の必要な試薬と水を加え、20マイクロリットルの最終体積を得る。384ウェルマイクロプレートに反応を加え、プレートリーダーを使用して蛍光時間の経過およびエンドポイントを測定します。血漿DNAの希釈系列を用いた自己溶解物を用いたGFP発現は、ナノモルDNAを1個でも強く発現する。
市販のライセートとオートリセートの間でGFP発現を比較すると、オートリセートは同等のレベルのGFPを産生した。異なる研究者によって2つの異なる実験室で作製されたライセートのバッチ間の変動は、約2倍以内であった。3つの最も重要な変数は、細胞ペレット対緩衝比であり、デブリを含まない上清を移動し、最終的な反応で最適なPEGおよびマグネシウム濃度を使用します。
抽出が準備されると、ClpXP媒介劣化やAHL媒介クォーラムセンシングなど、大腸菌細胞フリー発現システム用に開発された既存のプロトコルの大規模な兵器を使用できます。
