私たちのプロトコルは、研究者がミトコンドリアのエネルギー代謝とシームレスなスフェロイドをプローブし、いくつかの異なる細胞株、細胞数、表現型、ならびに分野の創薬および癌研究における薬物治療の比較を可能にすることを可能にする。我々の研究は、細胞単層実験と比較して優れた生理学的モデルを提供する3Dスフェロイドを用いてミトコンドリアエネルギー代謝を探索するための詳細なプロトコルを提示する。生物学的観察は、硝子体スフェロイドからin vivo腫瘍に外挿し、スフェロイド腫瘍代謝を標的とする可能性のある経路を同定することができる。
例えば、スフェロイド成長中の炭水化物有用性。タツノオトシゴの細胞外フラックス96器具のすべてのデータは非常に敏感である。アッセイプレート内のin vitroスフェロイドの位置決めは、単一のスフェロイドレベルで正確なデータを得るために最も重要です。
倍率4倍の位相差を備えた倒立光学顕微鏡を使用して回転楕円体の生存率を確認し、無傷の回転楕円体構造、形態、およびサンプル間の全体的な均一性を確保します。センサーカートリッジをハイドレートするには、約20ミリリットルのキャリブラントを円錐形のチューブにアリコートします。キャリブラントを入れた円錐形チューブを非二酸化炭素37°Cのインキュベーターに入れ、一晩置きます。
アッセイキットの内容物を取り出す。センサーカートリッジをユーティリティプレートの横に逆さまに置きます。200マイクロリットルの滅菌二重蒸留水をマルチチャンネルP300ピペットを用いてユーティリティプレートの各ウェルにピペットで入れた。
センサーカートリッジをユーティリティープレートの上に置きます。各井戸の水位がセンサープローブを水没させるのに十分な高さであるかどうかを確認します。組み立てたセンサーカートリッジを非二酸化炭素37°Cのインキュベーターに移し、一晩放置します。
スフェロイドアッセイマイクロプレートをコーティングするには、敗血症技術を用いて、スフェロイドマイクロプレートのウェルあたり30マイクロリットルの滅菌0.1ミリグラムあたり0.1ミリグラムの滅菌ポリD-リジン溶液を加える。回転楕円体マイクロプレートの各ウェルから溶液を吸引し、プレートを反転させ、ティッシュペーパーにしっかりと叩いて残留溶液を除去します。プレートの各ウェルを200マイクロリットルの滅菌二重蒸留水で洗浄する。
最後の洗浄後、マイクロプレートを反転させ、ティッシュペーパーにしっかりと叩いて残留水を取り除きます。プレートを30分間風乾させてから、後で使用してください。原稿に記載されているようにXF RPMI培地を準備します。
補充されたXF RPMIアッセイ培地をアッセイの1時間前に摂氏37度に予温する。コーティングしたスフェロイドアッセイ用マイクロプレートを非二酸化炭素摂氏37度のインキュベーター内で予温した。キャリブラントとセンサーカートリッジが入った円錐管をエアインキュベーターから取り出します。
センサーカートリッジをユーティリティプレートから取り外し、作業台に逆さまに置きます。P300マルチチャンネルピペットを使用して、ユーティリティプレートから水を吸引し、廃棄します。200マイクロリットルの予温キャリブラントをユーティリティプレートの各ウェルに加える。
センサーカートリッジをユーティリティプレートに置き、センサーがキャリブラントにしっかりと沈んでいることを確認します。組み立てたセンサーカートリッジを、ポート注入溶液をロードする準備ができるまで、非二酸化炭素、摂氏37度のインキュベーターに移します。スフェロイド培養プレートをインキュベーターから取り出し、顕微鏡下でスフェロイドを観察して、スフェロイド移動ステップの前にその完全性を確保します。
任意のバックグラウンド補正ウェルを含むスフェロイドプレートの各ウェルに180マイクロリットルの予温アッセイ培地をロードする。7センチメートルのペトリ皿を3ミリリットルのアッセイ培地で部分的に充填する。スフェロイドを96ウェル培養プレートからシャーレに移し、広いオリフィスピペットチップを装填したマルチチャンネルピペットを用いて、容量を10〜50マイクロリットルに設定した。
幅の広いオリフィスピペットチップを取り付けたシングルチャンネルピペッターの体積を20マイクロリットルに設定し、単一のスフェロイドを慎重に吸引します。このスフェロイドアッセイマイクロプレートの各ウェルの中央に先端を直接置き、毛細管現象を起こしてピペットチップからスフェロイドを抜き取る。ピペッターの内容物をペトリ皿にピペッティングして顕微鏡下で進化を確認します。
このスフェロイドがすべてスフェロイドアッセイマイクロプレートに移されたら、プレートを非二酸化炭素37°Cのインキュベーターに最低1時間移します。原稿に記載されているように各化合物の作業ストック濃度を調製し、完全に補充された予温XF RPMIアッセイ媒体を使用する。較正されたP100マルチチャンネルピペットを用いて、各化合物の20マイクロリットルの作業溶液をすべての対応するポートに分配した。
センサー・カートリッジをロードするためのアナライザーを準備します。十分に形成されたコンパクトなスフェロイドを得るために、各細胞株を、播種密度および培養期間について個別に最適化した。最適化された播種戦略では、SK-OV-3の回転楕円体体積は約5.46 x 10から7マイクロメートル立方体であり、A549では1.45 x 10から8マイクロメートル立方体であった。
すべての回転楕円体タイプは、初期播種密度と回転楕円体体積との間に線形相関を有していた。完全な回転楕円体対称性は円形度が1.0であり、1.0からの偏差は円形度の損失を示した。すべてのスフェロイドタイプにおいて、酸素消費率はスフェロイドサイズとともに増加し、MCF-7スフェロイドで最も高く、SK-OV-3スフェロイドで最も低いスフェロイド体積に直線的に相関していた。
MCF-7スフェロイドは、実験を通して車両制御に応答しなかった。MCF-7スフェロイドにおける酸素消費速度は、1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの最初の注射に続く5つの測定サイクル後にオリゴマイシンで低下した。BAM15に応答して、酸素消費率は、2回目の注入前に増加した。
一方、ロテノンとアンチマイシンAの組み合わせはそれを低下させた。基底ミトコンドリア呼吸を正確にプロービングするためのプロトコル。ADPリン酸化呼吸、リーク呼吸、カップリング効率、最大呼吸能力、および予備呼吸能力は、癌由来の3Dスフェロイドを用いて開発された。
すべての呼吸器化合物は、選択された化合物について予想される動力学的酸素消費速度プロファイルをもたらし、ウェル当たり毎分20〜30ピコモールの酸素の平均安定した基礎呼吸速度を明らかにした。マイクロプレート内のスフェロイドの位置と化合物注入後の測定サイクル数により、化合物添加間で呼吸数が安定するようにします。アンカプラーでミトコンドリア呼吸能力を探索する場合、濃度が重要であるだけでなく、ミトコンドリアのエネルギー代謝を調べる実験でアンカプラーの前に通常添加されるオリゴマイシンの存在下で呼吸を切り離す能力も重要です。
