これらのプロトコルは、嚢胞性線維症患者の肺マイクロバイオームに対する補助酸素使用のインビトロ効果をモデル化するように設計されている。このメディアレシピは、嚢胞性線維症で生活する人々のための痰の生理学的組成を反映するように調整されています。スペアリングプロセスは、異なる酸素条件下で培養する能力を導入します。
人工痰培地への変更により、他の慢性肺疾患を模倣し、同時嚢胞性線維症および糖尿病患者における異なるグルコース濃度などの他の条件下で微生物群集をモデル化することができる。人工痰培地調製のステップの概要は、調製されたASCM、ASMMおよびASBMの混合を示す。モップバッファーは、pHを6.3にテタリングするために使用され、媒体のフィルター滅菌は、軌道シェーカー上の冷たい部屋で行われます。
まず、ASMMを含む1リットルのボトルに250ミリリットルのASCMを加えて人工痰培地を調製します。その後、中程度のボトルにASBMの250ミリリットルを追加します。基本的な1つのモルモップバッファーで培地をタントレートし、pH紙で6.3のpHに到達します。
ろ過するまで人工痰培地を摂氏4度で冷蔵します。その後、濾過プロセスを開始するには、200ミリリットルの未濾過人工痰培地を0.22マイクロメートルの細孔サイズフィルタを備えた真空ろ過システムに移します。ろ過システムを真空ポンプに接続した後、真空ポンプをオンにしてから、チャンバーを軌道シェーカーに置き、冷たい部屋で1分あたり90回転で摂氏4度で揺れます。
350ミリリットルの媒体が詰まりの問題を克服するためにフィルタリングされた後、フィルタを変更します。かなりの量が濾過された後、濾過のための余分な150ミリリットルの媒体で。すべての媒体が濾過されるまで、追加のチャンバーで濾過を繰り返します。
オートクレーブされた血清瓶に人工痰培地に患者の痰を添加することを示す酸素スペアリングの概要。その後、密封された血清瓶を混合ガスでスパージします。最後に、血清瓶をインキュベートし、その後のメタゲノミクスシーケンシングのための24時間間隔で培養アレック・ワッツを得る。
血清ボトル培養スパージングを開始するには、サンプル識別子、接種日時、および目標酸素率を持つ500ミリリットルオートクレーブ血清ボトルをラベル付けします。生物学的フードに、セットアップされている各血清瓶に人工痰培地の24ミリリットルを加えます。各培養条件に十分なサンプル量を得るために、必要に応じて、滅菌リン酸緩衝生理食塩水でサンプルを希釈し、次いで18ゲージ針で痰を均質化し、患者痰の1ミリリットルを各血清瓶に加える。
次に、滅菌ピンセットを使用して、オートクレーブされたゴムストッパーを各血清瓶の上部に置き、ストッパーの下側に触れることなくゴムストッパーを押し下げる。ボンネットからボトルを取り外した後、アルミニウムシールを塗布し、圧着します。シールの目玉を取り出し、アルコール拭きでボトルの上部を拭き取り、ブンゼンバーナーの炎を通してボトルシールを渡します。
今、フィルターでプランジャーリストシリンジに無菌、18ゲージ針を固定し、最初にボトルに貼り付けられたガス放出注射器を挿入します。滅菌、18ゲージの針をシステムからのガス出力に固定し、ガス出力針をボトルにも挿入します。タンクから T 接合を酸素モニタを通してルーティングします。
システム内を流れる目標酸素濃度を検証した後、ガス流量の毎分約5リットルを目標とする。タンクからガス出力まで T 接合部を再ルーティングします。ガスが血清瓶を通って流れ始めると、圧力計に細心の注意を払い、圧力が予想外に上昇した場合は、すぐにシステムを停止します。
走行後、1分間に5リットルで1分間、血清瓶を通して酸素がスパージし、設定は10の空気交換を可能にし、内部雰囲気が100%酸素の所望の濃度に達することを確認する。ガス放出、18ゲージの針を取り除きます。血清瓶内の圧力を1気圧にして1気圧にした後、すぐにガス出力針を取り外します。
3、24時間間隔で1分あたり150回転で37°Cインキュベーターシェーカーで血清ボトルをインキュベートします。Alec Watts は、ダウンストリーム解析のために 24 時間間隔ごとに取得され、サンプルは毎回取り込まれます。この例は、培養前後の文化の外観を示しています。
流出酸素およびpHレベルは、37°Cで維持された痰サンプルの培養過程で測定した。12時間と24時間の両方のスパージング間隔で、酸素濃度は、3つの条件すべてについて観察された酸素濃度の中程度の低下と時間の経過とともにほぼ維持された。測定されたpHレベルは、時間の経過とともに有意な変化を伴う生理学的範囲内であった。
未培養および培養痰の間の微生物負荷、多様性およびコミュニティ組成の比較により、培養痰中の微生物負荷が20倍に増加することが明らかになった。多様性指標は、文化プロセスによってもたらされる世界的な違いを最小限に抑えたコミュニティ構成の保全を示した。培養および未培養の喀痰中の120種の微生物の比較分析を、メタゲノムシーケンシングにより行った。
これらの種のうち46種は、未培養および培養サンプルの両方で同定された。35は未培養サンプルで独占的に同定され、39は培養サンプルで独占的に同定された。吸収体ベースの成長曲線は、通常の21%酸素濃度の患者試料分離株から人工痰培地で培養された一般的なCF肺病原体に対して生成された。
ASMの600ナノメートルの光学密度の経時変化は、唯一の負の対照は汚染のない培養を示した。観察された典型的な成長曲線パターンは、ASM培地が光学法を用いた成長曲線の生成に使用できることを示す。メタゲノムシーケンシングは、微生物群集組を記述するためにここで使用されます。
メタトランスクリプトームシーケンシングなどの他の技術は、代謝産物の産生を評価するために遺伝子発現または代謝産物を評価するために使用することができる。
