ROMAは、嚢胞性線維症のある被験者とない被験者のオルガノイドを、病気の原因となるCFTR変異が2つ未満しか見られない場合、および汗のフッ化物が中間である場合に区別できます。ROMAは、すべての年齢層で、合併症の発生率が低い状態で実行できます。分析は半自動化され標準化されており、生検は分析のために中央研究所に送ることができます。
ROMAに使用されるオルガノイドは、CFTR調節効果にアクセスするためにも使用でき、ROMAはCFTR機能の回復度の測定に役立つ可能性があります。メッキの1日後、オルガノイドをカルシウムグリーンで染色します。蓋をした状態でプレートを数回回転させてわずかに傾け、ウェル全体でカルシウムグリーンが均一に分布するようにします。
プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で15〜30分間インキュベートして、ウェル内のすべてのオルガノイドを確実に染色します。オルガノイドに焦点を合わせるには、最適なX位置とY位置を決定し、共焦点顕微鏡を使用して各ウェルのオルガノイドに手動で焦点を合わせます。そして、これらの位置をイメージングソフトウェアに保存します。
次に、ライブセルイメージング設定を使用して、発光を488ナノメートル、励起を515ナノメートルに設定し、LD倍率対物レンズを5倍に設定します。オルガノイド画像を取得するには、共焦点顕微鏡で解像度1024ピクセル×1024ピクセル、深度16ビットの単位指向性で画像を撮影します。レーザー強度とマスターゲインを選択して、嚢胞性線維症と非嚢胞性線維症オルガノイドの形態学的差異を最適に視覚化します。
実験を開始して画像をキャプチャします。その後、32ウェルすべてのウェルごとに1枚の画像を顕微鏡形式で保存し、TIFFファイルとしてエクスポートします。まず、TIFFファイルを画像解析ソフトウェアにロードしてから、オペレーターが決定した除外基準に基づいて最初の品質チェックを実行します。
めっき密度が不十分な場合、オルガノイドが多すぎるか少なすぎる場合、および蛍光分布が不十分な場合に、分化または死んだ構造または破片が多数存在する場合は、一連の写真を除外します。解析用の画像を準備するには、オルガノイド培養ごとに全32枚の画像からなるネットワークデータファイルを1つ作成して開き、被験者ごとに32枚の画像すべてを同時に解析できるようにします。また、1ピクセルが2.5 x 2.5マイクロメートルに対応するように画像を再調整します。
次に、強度の下限しきい値4, 500、上限しきい値65, 535を使用して構造を描き、スムーズでクリーンな機能をオフにし、穴埋め機能をオンにし、分離機能を3倍にします。オルガノイドをカウントするには、40マイクロメートル以上のすべての構造を選択します。次に、ND測定の更新ボタンをクリックすると、カウントされたオルガノイドに番号が付けられます。
計算のために強度と真円度を測定するには、60マイクロメートル以上のすべての構造を選択してカウントします。次に、画像の境界線に接しているすべての構造を削除します。次に、60マイクロメートル以上の構造体の境界から1画素侵食し、各構造体の平均強度を測定する。
その後、60マイクロメートル以上のすべての構造体を再度選択し、60マイクロメートル以上の構造体の境界から10ピクセル侵食します。次に、侵食された各構造の平均強度と各構造の円形度を測定します。そして、各々の境界から25マイクロメートル侵食した後の強度測定値を、各々の境界から2.5マイクロメートル侵食した後の強度測定値の平均で除して強度比を算出し、60マイクロメートル以上、60マイクロメートル以上の構造体とする。
原稿に記載されているように、ソフトウェアによって決定された除外基準に基づいて2番目の品質チェックを実行します。212人の被験者からオルガノイドを収集し、画像化した。23セットの写真を除外した後、嚢胞性線維症およびCFTR変異を引き起こす2つの疾患を有する167人の被験者からのオルガノイド画像、および22人の非嚢胞性線維症被験者から分析したところ、培養物あたりのオルガノイドの平均数は1,519であることがわかった。
強度比および円形度指数は、嚢胞性線維症の有無にかかわらず被験者からのオルガノイドについて決定された。これら2つの指標を用いて、嚢胞性線維症を有する被験者と有しない被験者のオルガノイド間の完全な識別は、32ウェルすべてのデータを使用した場合だけでなく、各培養物に対して8つのウェルをランダムに選択した場合にも得られた。円形度の値の分布、オルガノイドの中央部分の強度、およびオルガノイド全体の強度を示す4つの例示的培養のヒストグラムが得られました。
強度比と円形度指数を正確に計算するには高品質の画像が必要となるため、品質管理は不可欠です。ROMA用に確立されたオルガノイド培養は、CFTR処理の効果をテストするための物理補助にも使用できます。RNA、DNA、およびタンパク質を抽出して、CFTR変異体のさらなる特性評価を行うことができます。
