このプロトコルは、ポリマーナノ粒子を調製する方法を示すため、重要であり、核酸を1つの簡単なステップでカプセル化した。この技術の主な利点は、汎用性であり、異なる核酸および細胞タイプに適用することができる。粒子調製のための簡単な手順の使用は、例えば上下のピペット、および凍結乾燥によってナノ粒子およびドラム条件の安定性を拡張する可能性。
この手順のデモンストレーションは、ローラ・オルモ、コーラル・ガルシア=フェルナンデス、マリア・スタンパ・ロペス=ピント、マリア・ナヴァロン=ロペス、私たちの研究室の博士課程の学生、マルタ・ディアス・カバジェロです。ポリプレックス形成の場合、以前に調製したポリマー、C6ペプチド、ポリβアミノエステル、およびボルテックス溶液を解凍する。ポリマーを上下に混合した後、酢酸ナトリウムに12.5ミリモル溶液を調製する。
溶液を渦に入れ、10分待ちます。次に、ミリリットル当たり0.5ミリグラムでmRNAを調製し、ピペット処理で混合する。ポリマー溶液を再びボルテックスし、ポリマー溶液中の遺伝物質溶液をマイクロ遠心管で1対1の比率で混合し、サーモブロックで30分間摂氏25度でチューブをインキュベートする。
インキュベートは、水を含むマイクロ遠心分離管にサンプルを加えることによって1〜2個のRNaseフリー水で混合物を沈殿させた後、賦形剤を含ませ、mRNAとポリβアミノエステルの混合物と同じ体積に20ミリモルヒープおよび4%スクロース溶液を加え、ピペット処理によって混合した。ポリプレックス溶液をマイナス80度で1時間凍結した後の凍結乾燥のために、一次乾燥を行い、水分補給を避けるためにポリプレックスをマイナス20°Cですぐに保存します。ポリプレックス再懸濁液の場合、乾燥したナノ粒子をマイナス20°Cのフリーザーから取り出し、対応する量の深い水素化水を迅速に添加して固体を再分散させ、所望の濃度を達成した。
ピペットは完全な再懸濁液まで穏やかに溶解し、ピペットは泡を積極的に避け、上下に上下に。蛍光顕微鏡による定性的評価のためのトランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされたヘラ細胞を含む96ウェルプレートを顕微鏡に載せ、目的の10倍を用いて可視化を開始する。まず、ホワイトバランスを適用してソフトウェアの背景参照を作成し、次に画像を取得して、解析中に画像を蛍光画像にオーバーレイします。
顕微鏡モードを反射モードに変更し、フィルターホイールを青色レーザーに移動してEGFPを可視化します。その後、同じ露光時間を採用するすべての条件や井戸の画像を取得します。フローサイトメトリーによる定量評価のために、1ウェルあたり100マイクロリットルのPBSを使用して96ウェルプレートでトランスフェクトされたヘラ細胞を洗浄します。
1ウェルあたり25マイクロリットルのトリプシンでPBSを吸引し、摂氏37度で5分間インキュベートした後。細胞が剥離したら、以前に回収された培地を添加してトリプシンを不活性化し、ウェルあたり10%ホルマリンの31.25マイクロリットルを加え、20分間インキュベートして細胞を固定します。次にフローサイトメーターとソフトウェアをオンにし、プレートサンプルのボリュームの種類や、サンプル間の揺れやすすいなどの他のパラメータを含む、実験に適した条件を設定します。
最初に前方散乱光と側面散乱光の流量データを見て細胞を破片から区別することによって、正にトランスフェクションされた細胞の割合を定量化するための適切なパラメータを設定します。そして、振幅対高さをゲートと比較し、個々のセルを判別して、別の散布図をプロットします。トランスフェクションの1日前に、プレート10,000 JAWS II細胞を一晩インキュベーション用の96ウェルプレートでウェルした。
翌日、ウェルあたり0.6マイクログラムのmRNAで細胞をトランスフェクトし、37°Cと5%の二酸化炭素で乾燥空気インキュベーターでプレートを24時間インキュベートします。翌日、25マイクロリットルのPBSでウェルに残った細胞を洗浄する。25マイクロリットルのトリプシンでPBSを吸引し、37°Cで5分間プレートをインキュベートして細胞を取り外します。
以前に回収したメディアを対応する井戸に追加して、トリプシン反応を停止します。その後、プレートを遠心分離し、培地を吸引し、PBSあたり50マイクロリットル、ホルマリン2.5%を加えて20分間摂氏4度でプレートをインキュベートし、プレートを遠心分離機で固定します。その後、PBSの50マイクロリットルとウェルあたり3%BSAを追加し、4°Cで30分間インキュベーター。
プレートを再びインキュベーション遠心分離した後、PBSに50マイクロリットルのマウスオボアルブミン抗体を加え、3%BSAとインキュベーターを摂氏4度で30分間加えます。遠心分離工程を繰り返し、その後、50マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄する。PBSを吸引した後、二次抗体を加え、摂氏4度で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、遠心分離と洗浄の手順を繰り返します。次に、細胞と100マイクロリットルのPBSと2.5%ホルマリンを再懸濁して、フローサイトメトリー分析を行います。ナノ粒子を封入した新鮮で凍結乾燥したGFP mRNAの物理化学的特徴付けは、サイズおよびポリ分散度指数に有意な差を示さない。
ポリプレックスの透過電子顕微鏡は、直径約50ナノメートルの球形およびモノ分散ナノ粒子の形成を確認します。GFPを封入するレゴペプチドおよび修飾ポリβアミノエステルポリプレックス、またはオボアルブミンのカプセル化効率データは、mRNAの種類に応じて有意差を示さない。EGFP発現の定性的分析を、JAWS II細胞株における24時間の事後のトランザクションをここに示す。
負のコントロールと定量的に比較した。パーセントGFP陽性細胞は、古典的なトランスフェクション試薬で行われる陽性対照と有意に高く、同等である。オボアルブミンmRNAはオリゴペプチドおよび修飾ポリβアミノエステルナノ粒子を含み、非トランスフェクト細胞と比較してトランスフェクト細胞におけるCD11bおよびCD86膜マーカーの顕著に高い発現によって見られる樹状細胞を活性化することができる。
活性原理としてのmRNAの使用に基づく当社のワクチン接種プラットフォーム、ならびに当社独自のポリマーは、予防および癌治療薬に使用されるように適応することができます。私たちは、がん免疫療法に貢献することを強調するために私たちの技術を使用することができます。ナノ粒子に腫瘍関連抗原をカプセル化し、がん治療を変えることができるから。
