自己組み立てタンパク質ナノ粒子(SAPN)は、様々な感染症に対するワクチンの開発に使用できます。ここで説明するこの方法を使用して、6 らせんバンドルを含む SAPN を精製、再折り、および特徴付けることができます。このナノ粒子は、天然型の立体構造で三量体抗原を提示することができる。
わずかな変更を加えれば、この方法は他の革新的なSAPNワクチン構築物に適用することができます。さらに、臨床試験のために大規模生産に容易に移すことができる。6ヘリックスバンドルSAPNを発現する収穫された大腸菌のリシスについては、4秒間の超音波処理と6秒間の残りの150ワットの超音波出力を備えたプローブを使用して、氷上のイミダゾールフリーバッファーの40ミリリットルで再懸濁された細菌ペレットを5分間超音波処理します。
細胞リセートを遠心分離して、清澄上清を生成し、上清を滅菌150ミリリットルフラスコに移す。次に、新鮮なイミダゾールフリーバッファーで100ミリリットルの最終体積までサンプルを持って来ます。目的のタンパク質を分離するには、FPLC ソフトウェアを開き、[新しい方法] オプションをクリックします。
[メソッド設定]メニューで、[列の位置]ドロップダウンメニューを開き、[C1ポート3]を選択します。[テクニック別に表示] ドロップダウン メニューで、[アフィニティ] を選択します。[列タイプ] ドロップダウン メニューで、[その他]、[HisTrap HP]、および [5 ミリリットル] を選択します。
[列の体積]ボックスと[圧力]ボックスは、自動的に適切な値に設定されます。[メソッド アウトライン]をクリックし、[フェーズライブラリ]メニューを閉じる前に、矢印の横にある[フェーズライブラリ]ポップアップメニューから[平衡]ボタンと[サンプルアプリケーション]ボタン、3つの[列の洗浄]ボタン、および[溶出]ボタンをドラッグします。[均衡]をクリックし、表に示す値を初期バッファB、4%最終バッファB、4%、カラムボリューム、5に設定します。
[サンプル アプリケーション] をクリックします。[サンプルの読み込み]ボックスで、[サンプル ポンプで列にサンプルを注入]ラジオ ボタンをクリックし、[システム ポンプでのサンプルインジェクション]ボックスの[メソッド設定から流量を使用]の横にあるチェックボックスがオンになっていることを確認します。[ボリューム ボックス] の値を 100 ミリリットルに変更し、[分数コレクション] スキームを有効にします。
[方法設定から分数サイズを使用]ボックスをクリック解除し、[分率サイズ]を4ミリリットルに変更します。最初の[列の洗浄]ボタンをクリックし、表に示す値を初期バッファB、4%最終バッファB、4%、カラムボリューム10に設定します。[分数コレクションスキームの有効化]ボックスをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用]をクリック解除します。
[分率サイズ]を4ミリリットルに変更し、2つ目の[列の洗浄]ボタンをクリックします。テーブル内の値を初期バッファ B、0%最終バッファ B、0%、カラムボリューム、5 に設定します。[分数コレクションスキームの有効化]ボックスをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用]をクリック解除します。
[分率サイズ]を4ミリリットルに変更し、3つ目の[列の洗浄]ボタンをクリックします。テーブル内の値を初期バッファ B、0%最終バッファ B、0%、カラムボリューム 10 に設定します。[分数コレクション スキームの有効化] ボタンをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用] ボックスをクリック解除します。
次に、分率サイズを4ミリリットルに変更します。[溶出]ボタンをクリックし、テーブル内の情報を右クリックします。ポップアップメニューで「ステップを削除」をクリックし、2 つのエントリが表示されるように、表に「等角グラデーション」ボタンを2回ドラッグします。
最初のエントリの値を初期バッファ B、30%最終バッファ B、30%、カラムボリューム、10 に設定します。2 番目のエントリの値を初期バッファ B、100%最終バッファ B、100%、カラム ボリューム、10 に設定します。[分数コレクション スキームの有効化] ボタンをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用] ボックスをクリックします。
次に、[名前を付けて保存]をクリックし、ファイルの浄化に名前を付けます。FPLCのポンプAチューブをイミダゾールフリー洗浄バッファーに入れ、ポンプBチューブを500ミリモル・イミダゾールバッファーに入れます。サンプルポンプチューブを100ミリリットルのサンプルに入れ、精製プログラムを実行します。
60%イソプロパノール洗浄が必要な場合は、プログラムを一時停止し、イミダゾールフリー洗浄から60%イソプロパノール洗浄にポンプAチューブを移動し、プログラムを再起動します。洗浄の最後に、プログラムをもう一度一時停止し、ポンプAチューブをイミダゾールフリーの洗浄バッファに戻し、精製プログラムを再開します。精製したタンパク質の純度を評価するには、まず流れから分率を組み合わせ、1つを洗浄し、2つを洗浄し、3つのステップを、個々の50ミリリットル円錐形チューブで洗浄します。
次に、各サンプルチューブから15マイクロリットルを個々の0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に2Xレムリバッファー15マイクロリットルと混合し、95°Cでサンプルを10分間変性させます。インキュベーションの最後に、トリスグリシンSDS-PAGEランニングバッファに3つの染色フリー4〜20%プレキャストポリアクリルアミドゲルを備えたゲルランニング装置を設置します。各ゲルの最初のウェルに分子量マーカーの8マイクロリットルをロードし、他のウェルに変性サンプルの30マイクロリットル。
染料の前面がゲルの底に当たるまで200ボルトでゲルを実行し、脱イオン水でゲルを短時間リンスしてから、すぐに染色を含まないイメージングシステムでイメージングします。次に、正しいサイズのタンパク質バンドを含む分数を特定し、これらの画分をプールします。6ヘリックスバンドルSAPNリフォールディングの場合、10キロダルトン分子量カットオフ透析カセットに10〜20ミリリットルのプールタンパク質を加えます。
カセットを8つの臼歯尿素、20ミリモルトリス、5%グリセロール、5ミリモルTCEPの室温で一晩透析する。翌朝、透析バッファー内の尿素濃度を2時間ごとに2モルずつ段階的に減少させて、尿素をサンプルからゆっくりと透析する。尿素濃度が2モルに達したら、透析装置を摂氏4度に移動し、サンプルを120ミリモル尿素、20ミリモルトリス、グリセロール5%に透析して一晩で再折り畳みを終了します。
翌朝、カセットからリフォールドされたタンパク質を取り除き、0.22マイクロメートルのポリビニリデンフッ化物注射器フィルターを通して6ヘリックスバンドルSAPNをフィルター処理します。6ヘリックスバンドルSAPNの平均粒径を測定するには、6ヘリックスバンドルSAPNの45マイクロリットルを使い捨てキュベットに追加し、そのキュベットをDLSマシンに入れます。次に、新しい測定ファイルを作成し、120ミリモル尿素、20ミリモルトリス、および摂氏25度の5%グリセロールバッファーでタンパク質の事前に書かれた標準的な操作手順を実行します。
次に、測定を開始します。Z平均サイズ、PDI、分布結果は、各実行に対して計算されます。機械はサンプルを5回読み取る。
この完全に組み立てられた6つのヘリックスバンドルSAPNは、モノマーの60コピーを含む粒子に折り畳まれると予測されるタンパク質配列に基づいて構築されています。全細胞リセートを使用して、ニッケルカラムを用いてFPLCにより6ヘリックスバンドルSAPNモノマーを精製し、タンパク質が150ミリモルイミダゾールと500ミリモルイミダゾールの両方で溶出したことを実証した。クロマトグラムはまた、イソプロパノール洗浄とイミダゾールフリー洗浄に対応する185および210ミリリットルの総体積で他の2つのピークを示す。
組換えタンパク質の画分と純度は、主に画分68〜79に位置する目的のタンパク質を有する勾配SDS-PAGEゲルによって同定することができた。抗Hisおよび抗167D4抗体によるウェスタンブロット分析は、プールされた分画が実際に関心のあるタンパク質であることを示した。このブロットは、6ヘリックスバンドルSAPNマルチマーの存在も実証しました。
目的のタンパク質モノマーを含むサンプルを透析および粒度分布によって完全に組み立てられた6ヘリックスバンドルSAPNに折りたたみ、DLSおよびナノ粒子追跡分析によって決定した。透過電子顕微鏡による可視化により、2つの粒子サイズ化技術から得られたサイズ分布を有する、個々の6ヘリックス束SAPN粒子が明らかになった。このプロトコルで最も重要なステップは、6 ヘリックスバンドル SAPN のリフォールディングです。
リフォールディングバッファーの正しい pH およびイオン強度が必須です。精製時にイソプロパノール洗浄を行い、汚染LPSを極めて低いレベルにまで低減することができました。ただし、必要に応じて、アニオン交換カラムを使用してLPSをさらに削減することができます。
この技術は、人間のアプリケーションに容易に適応することができます。細菌表現のSAPNは、今後のフェーズ1/2aマラリア臨床試験のためにすでにスケールアップされています。
