異なるエネルギー基質の使用は、細胞型特異的および疾患指標の両方である。特定の基質の消費量を測定することは、正常な生物学と病理学の両方に光を当てることができます。この技術は特別な機器を必要とせず、スケーリングが容易です。
また、以前に公開された方法よりも使いやすいです。基質酸化速度の変化を理解することは、代謝障害に対する食事的および薬理学的介入の開発を可能にするであろう。骨組織で実証されていますが、この技術は、代謝シフトの原因と結果の両方を理解するために、すべての細胞タイプの代謝柔軟性を研究するために容易にカスタマイズできます。
生後3〜5日の子犬を犠牲にした後、ペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む氷冷D PBSに移す。皮膚および軟部組織を除去することによって頭蓋骨を露出させる。D PBSで周囲の組織を背中から前へ切断して中間領域を採取する。
ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく傷つけ、その後の消化時に細胞を解放するのを助けます。D PBS中のコラゲナーゼ2型1ミリリットル当たり2ミリグラムおよび4ミリグラムの溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22マイクロメートルフィルターで濾過する。まず、洗浄した頭蓋骨を1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液2ミリグラムで15分間消化し、次いで消化液を捨てる。
次に、清浄なサンプルを1ミリリットルあたり4ミリグラムのコラゲナーゼ溶液に3回ずつ15分間消化する。その後、消化液を引っ張って保存します。消化液を70マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、ろ液を300RCFで5分間遠心分離します。
細胞ペレットを10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む完全なMEMアルファ培地に再懸濁する。細胞を数えて10センチメートルのプレートに播種する。細胞を摂氏37度のインキュベーターで5%二酸化炭素で3日間培養する。
次いで、0.25トリプシンEDTAで摂氏37度で細胞を解離させる。消化後、細胞を数え、10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む完全なMEMアルファ培地で24ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。基質当たり細胞型当たり少なくとも4ウェルをシードし、プレアッセイ計数のために細胞タイプごとに少なくとも3つの余分なウェルをシードする。
細胞を摂氏37度で一晩培養する。8週齢のマウスから筋肉と結合組織を除去し、大腿骨と脛骨を採取した後、鋭いはさみで骨の両端を切り取って捨てる。10%FBSペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液、および10%CGM 14 12馴化培地を含む15ミリリットルの完全なMEMアルファ培地を含む23ゲージ針を取り付けたシリンジを備えた新鮮な10センチメートルのペトリ皿に骨髄を洗い流す。
シャーレ内の細胞を、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーター内で培養する。3日後、培養培地を捨て、細胞をD PBSでリンスした。付着した細胞を摂氏37度で0.25%トリプシンEDTAで5分間解離させる。
遠心分離後、細胞ペレットをBMM培地に再懸濁する。細胞をカウントし、前述の手順に従って24ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。アッセイを開始する前にBMM培地中で摂氏37度で一晩培養した。
余分なウェル内の細胞をD PBSで2回洗浄する。細胞を0.25%トリプシンEDTAで解離させる。20マイクロリットルの消化細胞をD PBSに再懸濁する。
20マイクロリットルのアクリジンオレンジとヨウ化プロピジウム色素溶液を用いて、自動細胞カウンターで生細胞数を決定し、その数を記録する。アッセイウェル内の細胞をD PBSで2回洗浄する。500マイクロリットルの高温培地をRAM指定の組織培養フード内の各アッセイウェルに加える。
プレートをパラフィルムで密封した後、RAM指定のインキュベーター内で細胞を摂氏37度で4時間インキュベートする。インキュベーション中は、ろ紙を1.5ミリリットルのマイクロ遠心管のキャップ内の面積よりわずかに大きい円形に切り、紙をキャップにぴったりと挿入します。各チューブに1モル過塩素酸100マイクロリットルを加え、キャップの内側に取り付けたろ紙に20マイクロリットルの水酸化ナトリウムを加える。
細胞をインキュベートした後、各ウェルから調製したチューブに400マイクロリットルの培養培地を移し、直ちにキャップを閉じる。チューブを室温でチューブラックに1時間放置する。インキュベーション中の平行四辺形は、各チューブにシンチレーションバイアルをセットアップし、4ミリリットルのシンチレーション流体で満たします。
ろ紙の各片をシンチレーションバイアルに移し、室温で30分間インキュベートする。組織培養フード、ウォーターバス、冷蔵庫、インキュベーター、シンク、地面、およびその他の作業領域で、RAM汚染の可能性についてワイプテストを実行します。紙ワイプをシンチレーション液を含むシンチレーションバイアルに入れます。
シンチレーションバイアル中の炭素14放射活性をシンチレーションカウンターで測定し、読み取り結果を記録します。必要に応じて、放射線安全ガイドラインに従って作業環境を除染する。この図は、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化をBMMと比較したものである。
初代細胞を継代し、完全なMEMアルファ培地中で一晩培養した後、それらは典型的には80〜90%のコンフルエントに達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも著しく大きい。基質酸化の結果は、各基質の酸化速度がBMMよりも歯槽前骨芽細胞において有意に高く、前骨芽細胞における酸化的リン酸化によるより高いエネルギー産生を示す可能性が高いことを示した。
挿入された3番目の紙は、1.7ミリリットルのebinトップチューブキャップよりわずかに大きくする必要があります。この方法は、酸素消費と組み合わせて使用でき、細胞内の酸化的リン酸化および乳酸産生の全体的な速度を決定することができる。このプロトコルは、異なる分化段階または疾患設定中の基質使用を決定するために使用することができる。
この知識により、代謝障害に対する介入を開発することができます。
