グルコース処理などの他の代謝経路とは対照的に、脂肪酸合成は日常的に評価されていないため、代謝状態の解釈が不完全です。この方法の主な利点は、比較的非侵襲的であり、上流のグルコース処理の変化が結果に影響を与える可能性のある同位体標識グルコースを使用するよりも、脂肪酸合成フラックスをよりよく反映する可能性が高いことです。ここでは褐色脂肪組織に焦点を当てていますが、この方法は、あらゆるマウスモデルのあらゆる組織を研究するのに役立つ可能性があります。
まず、サンプルをドライアイスの上に置きます。事前にラベル付けされた微量遠心チューブを用意し、分析天びんの上に置き、天びんを風袋引きします。次に、ピンセットとメスまたはスチールカミソリの刃をドライアイスの上に10〜20秒間置き、冷まします。
ピンセットを使用して凍結組織サンプルをチューブから取り出し、ドライアイスの平らなブロックまたは別の予冷された表面に配置できるプラスチック製のウェイトボートに置きます。メスまたはスチール製のカミソリの刃を使用して、重量5〜15ミリグラムに相当する組織のごく一部を解剖し、微量遠心チューブに入れます。正確な重量を記録し、各試験片について繰り返します。
10ミリモルのヘキサデカン酸D31酸を1ミリグラムあたり1マイクロリットル添加し、続いて5ミリメートルのステンレス鋼ビーズを3個各サンプルに加えます。次に、250マイクロリットルのメタノール、250マイクロリットルの水、および500マイクロリットルのクロロホルムをビーズで各サンプルに加えます。粉砕機の予冷ブロックにチューブを入れ、25ヘルツの振動周波数でサンプルを5分間混合します。
磁石を使用してビーズを取り外し、サンプルを 12 、 000 G で 4 °C で 10 分間遠心分離します。マイクロピペットを使用して、各サンプルの底相を一定容量で、対応するラベルの付いた微量遠心チューブに入れます。残りのサンプルに500マイクロリットルのクロロホルムを加え、これらの手順を繰り返します。
結合した下相のチューブを窒素ガス下に置くか、クロロホルム耐性の冷蔵遠心真空に摂氏4度で完全に乾くまで置きます。98ミリリットルの無水メタノールをガラス培地ボトルにピペットで移します。そして、ドラフトに2ミリリットルの無水硫酸をゆっくりと加えて、メタノールに2%の硫酸を作ります。
閉じたボトルをくるくる回して混ぜます。この2%硫酸をメタノール溶液に500マイクロリットルずつ各サンプルに加え、短時間ボルテックスします。ヒートブロック上でサンプルを摂氏50度で2時間インキュベートし、各サンプルに100マイクロリットルの飽和塩化ナトリウム溶液と500マイクロリットルのヘキサンを加えます。
サンプルを室温で1分間激しくボルテックスし、サンプルを1分間放置します。この後、2つのフェーズが明らかになります。上相を新しい微量遠心チューブに集めます。
次に、ヘキサンの添加を繰り返します。そして、相分離後、2番目の上相サンプルを同じラベル付きチューブに集めます。サンプルを窒素ガス下で室温で乾燥させ、元の組織重量1ミリグラムあたり20マイクロリットルのヘキサンにサンプルを再懸濁します。
サンプルをガラスインサート付きのガラスガスクロマトグラフィーバイアルにすぐに移します。サンプルを 1 台のクワッドガスクロマトグラフィー質量分析計に注入して、脂肪酸メチルエステル(FAME)同位体の存在量を測定します。ヘリウムをキャリアガスとして使用して、1マイクロリットルのサンプルを、摂氏270度の入口温度でスプリットまたはスプリットレスインレットに注入します。
ラベル付きセーフロック微量遠心チューブでは、各血漿サンプル10マイクロリットル、または標準4マイクロリットルの10モル水酸化ナトリウムと4マイクロリットルの5%アセトンをアセトニトリルに混ぜ合わせます。これをサンプルごとに 3 回に分けて実行します。サンプルを室温で一晩インキュベートした後、各サンプルに450〜550ミリグラムの硫酸ナトリウムを加え、ドラフト内の各チューブに600マイクロリットルのクロロホルムを加え、15秒間激しくボルテックスします。
サンプルを 300 G で 2 分間遠心分離します。ガラスインサート付きのラベル付きガラス製GCMSバイアルを用意し、上清のトリプリケートと80マイクロリットルのアリコートを各サンプルからバイアルに移します。GCMS 分析のためにバイアルをしっかりとキャップします。
複数の時点におけるマウスの血漿中のD2O濃縮の割合をここに示します。体水は2.5〜6%の範囲で濃縮され、体内水分中の重水素濃縮のベースラインレベルが1時間で急速に達成され、研究期間中維持されることがわかりました。室温、熱中性で D2O を 3 日間投与した後の褐色脂肪組織中のパルミチン酸の質量同位体分布をここに示します。
この結果は、室温でより高いM1およびM2重水素濃縮を示しています。室温で熱中性で3日間のD2O投与後の褐色脂肪組織のモル濃縮とさまざまな脂肪酸の血漿モル濃縮をこの図に示します。低温の濃縮は、褐色脂肪組織の幅広い脂肪酸に見られました。
特に、血漿中の総脂肪酸濃縮は褐色脂肪組織と同じ傾向をたどりませんが、代わりに、脂肪酸濃縮は熱中性とともに増加します。これらの画像は、D2O投与の3日後の褐色脂肪組織中の総存在量とde novo合成パルミチン酸を表しています。結果は、室温での総パルミチン酸合成の増加を示しています。
GCMSで脂肪酸を泳動させる場合は注意が必要です。パルミチン酸は人為的に高い同位体濃縮値を与える可能性があるため、過負荷にならないようにしてください。また、GCMS でアセトンを分析する場合は、サンプルを分析する前にバックグラウンドアセトンピークがないことを確認し、ブランクを実行してシステム内のアセトンを除去してください。
この方法では、複数の脂質クラスにわたる総脂肪酸を調べますが、脂肪酸合成が特定の脂質クラスにどのような影響を与えているかを理解したい場合は、まずクロマトグラフィーを使用してこれらの脂質クラスを分離し、次にこれらの画分から脂肪酸を抽出します。脂肪生成は正常な発生だけでなく、多くの疾患にも重要な貢献者であるため、このプロトコルは多くの分野で有用です。
