ハンチントン病は、HDは、ハンチンチンタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる不治の神経変性病理である。ハンチンチンは、主に小胞および微小管に関連しており、おそらく微小管依存輸送プロセスに関与する。微小管のダイナミズムに対する変異ハンチンチンの影響を研究するために、成長するプラスエンドを曲げて安定化させることによって微小管の動的特性を調節するEB3タンパク質の生体内視覚化を用いた。
蛍光標識されたEB3をヒト皮膚線維芽細胞にロードするために、プラスミドトランスフェクションを適用しました。この研究のために、EB3患者の皮膚生検から得るために原発性線維芽細胞培養を用いた。DMEM培地で数時間以内に検査室に生検を送り、ペニシリン1ミリリットル当たり15マイクログラム、ストレプトマイシン1ミリリットル当たり50単位で補う。
生検組織を6センチのペトリ皿に少量の培地と一緒に入れます。無菌メスを使用して、生検サンプルを約0.5〜1ミリメートルの大きさに切ります。1つ、2つ、得られた断片を3.5センチメートルのペトリ皿に入れ、生検片の上に無菌カバースリップを置きます。
ゆっくりと成長培地の1.5ミリリットルを追加します。培養繊維芽細胞は、CO2インキュベーター中の成長培地中で、5%CO2で7°C、湿度80%である。4日後、7日後、最初の角化細胞、次いで線維芽細胞が組織から皿の底に移行し始める。
細胞培養。トランスフェクションビジュアライゼーション、ガラス共焦点プレート皿、共焦点皿を使用する必要があります。蒸留水で作られたオートクレーブ0.1%ゼラチン溶液で皿底を覆います。
15分間インキュベートします。培地を準備します。完全に混ぜ、プラス4摂定で背の高い店。
細胞に追加する前に、プラス37摂氏に培地を温めます。顕微鏡下で培養を評価する。培地を取り出し、滅菌DPBSで細胞を洗います。
細胞に予温0.25%トリプシン溶液の1ミリリットルを追加します。基板から完全に切り離す場合は、顕微鏡下の細胞を確認してください。1ミリリットルの培養培地でトリプシンを非アクティブ化する。
細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐チューブに移します。チューブを200Gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、培養液の1ミリリットルで細胞パレットを再懸濁する。
セル番号をカウントします。必要なセル数を計算します。8から15の密度でそれらを解凍し、10を3の力に掛け、センチメートルで通過します。
これは、培養培地のミリリットルにパンされます。接種のために調製した培養皿からゼラチン溶液を取り出し、すぐに2ミリリットルの細胞懸濁液を加える。CO2インキュベーターでプラス37摂氏で線維芽細胞を栽培します。
2日、4日ごとにメディアをリフレッシュします。実験のために、4、11の通路の細胞を使用する。トランスフェクションの時点で、合流度は70以下で、80%トランスフェクションの24時間前に培養液を新鮮なものに置き換える必要があります。
細胞の播種の面積と密度に基づいて、DNA-脂質複合体を調製する。リポソームトランスフェクション剤は、1個の細胞播種の密度を、4細胞の電力に10を掛けて、1センチで通過した。オプティ-MEMの125マイクロリットルに3マイクロリットルの市販試薬を加え、抗生物質を含みない。
チューブの壁に触れることなく、穏やかに再中断します。プラスミドDNAを希釈してGFP-EB3、プラスミドDNAの1マイクログラムを125マイクロリットルのOptiMEMに添加した。穏やかに再中断します。
希釈されたトランスフェクション試薬の各チューブに希釈プラスミドDNAを1対1の比率で加える。30分間インキュベートします。細胞と6センチメートルペトリ皿にDNA脂質複合体を追加します。
十字架のスイングと30秒間混ぜます。細胞をトランスフェクション剤で24時間インキュベートし、培地を新鮮なものに変えます。24時間と48時間で検査後の効率を分析します。
イメージングの準備をしています。細胞の生撮像前に、自己蛍光を低減するためにPH指標色素のない培地に培養培地を変更する。培地を完全にカバーするために培地細胞相に慎重に鉱油を塗布し、外部環境から単離してO2の浸透を低減し、媒体の蒸発を減らします。
マクロランプと、画像を撮るために、高い数字の開口部を持つ60倍、100倍の対物レンズのすべての画像を使用してください。生体内観察のために、顕微鏡は、光学表を打つなど、細胞に必要な条件を維持するためにインキュベーターを装備する必要があり、レンズは37摂氏を通過し、密室はCO2供給、湿度レベルの支持を得る必要があります。画像化の前に、顕微鏡のホルダーに細胞と共焦点皿を置きます。
画像を撮りながら漂わないように、皿とカメラがホルダーにしっかりと取り付けられていることを確認してください。イメージング パラメータを設定します。スライドは細胞損傷を誘発するので、低露出値を選択し、酸素空間と反応します。
ヒト皮膚線維芽細胞における微小管の動態を研究するために、我々は300ミリ秒の曝露を選択した。関心のある対象に焦点を当てます。長時間、タイムラプスイメージング、自動フォーカス安定化システム、完璧なフォーカスシステムが必要であり、設定された軸に沿ってシフトが存在する可能性があるため、対象物は焦点が合っていない。
セルの光感度とフレアクロムのフェージングの速度に応じて、最適なイメージング条件を選択します。微小管は非常に動的な構造であるため、合理的に短時間で選択することができ、フレームレートは十分に高くなければなりません。皮膚線維芽細胞の微小管ダイナミクスを調べるには、毎秒1フレームの頻度を3分、5分間使用しました。
画像を取得する次のオブジェクトを選択する際には、既に画像化された領域から離れて、光の影響下で、露光可能なフォトブリーディングが存在する。比較的高い画像周波数を使用していたため、画像間のシャッターが閉じ、光が撮影の全期間遅れとなり、フェードが増えています。トランスフェクションの品質、微小管画像の品質、最適な信号対雑音比、分析された細胞のドリフトの欠如を考慮して、微小管ダイナミクスを視覚的に研究するための最適なビデオを選択します。
選択したビデオを使用して、フィジープログラムでトラスして微小管プラスエンドダイナミクスを研究します。プロトコルの最も重要なステップはトランスフェクションであり、十分なタンパク質発現を保証します。良好な信号対雑音比、微小管の光化、および細胞の漂流の欠如は、イメージングにとって重要です。
微小管ダイナミクスのインビボ視覚化は、変異ハンチンチンの特性に関する重要な情報を提供する。我々のプロトコルは、その病理が細胞骨格の動的特性を含む他の疾患の研究に適用することができる。
