A doença de Huntington, HD, é uma patologia neurodegenerativa incurável causada por uma mutação na proteína de caça de codificação genética. A huntingtin está associada principalmente a vesículas e microtúbulos, e provavelmente envolvida em processos de transporte dependentes de microtúbulos. Para estudar a influência da caça mutante no dinamismo dos microtúbulos, utilizamos a visualização in vivo da proteína EB3, que regula as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, dobrando e estabilizando o crescimento de plus-ends.
Para carregar EB3 fluorescentemente rotulado em fibroblastos de pele humana, aplicamos transfecção plasmida. Utilizamos a cultura do fibroblasto primário para obter a partir da biópsia de pele do paciente EB3 para este estudo. Entregue a biópsia em laboratório dentro de algumas horas em meio DMEM, suplementada com 15 microgramas por mililitro de penicilina, e 50 unidades por mililitro de estreptomicina.
Coloque tecido de biópsia em uma placa de Petri de seis centímetros, juntamente com uma pequena quantidade de meio. Usando um bisturi estéril, corte a amostra de biópsia em pedaços de cerca de 0,5 a um milímetro de tamanho. Coloque um, dois, obteve fragmentos em uma placa de Petri de 3,5 centímetros, e coloque uma tampa estéril sobre as peças de biópsia.
Adicione lentamente 1,5 mililitros de um meio de crescimento. Fibras culturais no meio de crescimento em uma incubadora de CO2, em 5% de CO2 que é de sete centígrados, 80% de umidade. Depois de quatro, sete dias, primeiro queratinócitos, então os fibroblastos começam a migrar do tecido para o fundo do prato.
Cultivo de células. Para visualização de transfecção, pratos de placa confocal de vidro, pratos confocal devem ser usados. Cubra o fundo do prato com solução de gelatina autoclaved 0,1% preparada em água destilada.
Incubar por 15 minutos. Prepare o meio de cultura. Misture bem, armazene alto em mais 4 centígrados.
Aqueça o médio para mais 37 centígrados, antes de adicionar às células. Avalie a cultura sob o microscópio. Remova o meio e lave as células com um DPBS estéril.
Adicione um mililitro de solução pré-aquecida de 0,25% de trippsina às células. Verifique as células sob o microscópio se elas se desprendem completamente do substrato. Desativar trippsina com um mililitro do meio de cultura.
Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 200 G por cinco minutos. Remova o supernatante, resuspense a paleta celular em um mililitro do meio de cultura.
Conte o número do celular. Calcule o número necessário de células. Desemarmá-los com uma densidade de oito a 15, multiplicado por 10 ao poder de três, passou por um centímetro.
Isso é garimpado em mililitros do meio cultural. Remova a solução de gelatina do prato de cultura preparado para a inoculação e adicione imediatamente dois mililitros da suspensão celular. Cultivar fibroblastos a mais de 37 centígrados em uma incubadora de CO2.
Refrescar o meio a cada dois, quatro dias. Para experimentos, use as células de quatro, 11 passagens. No momento da transfecção, a confluência não deve ser superior a 70, 80% Substitua o meio de cultura por um fresco 24 horas antes da transfecção.
Prepare um complexo dna-lipíde, baseado na área e densidade da semeadura celular. Agente de transfecção liposômica, e a densidade da semeadura celular de uma, multiplicada por 10 ao poder de quatro células, passou por um centímetro foi usada. Adicione três microliters de reagente comercial a 125 microliters de Opti-MEM, sem antibiótico.
Sem tocar nas paredes do tubo, resuspenque suavemente. Dna plasmídeo diluído, GFP-EB3, adicionando um micrograma do DNA plasmídeo a 125 microliters de OptiMEM. Levemente resuspend.
Adicione DNA plasmídeo diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído, de uma a uma razão. Incubar por 30 minutos. Adicione o complexo lipídico de DNA à placa de Petri de seis centímetros com células.
Misture com um balanço cruciforme por 30 segundos. Incubar células com um agente de transfecção por 24 horas e, em seguida, mudar o médio para o fresco. Analise a eficiência após a inspeção em 24 e 48 horas.
Preparando-se para a imagem. Antes da imagem viva das células, mude o meio de cultura para um meio sem corante indicador PH para reduzir a autofluorescência. Aplique cuidadosamente o óleo mineral na fase média celular para cobrir completamente o meio, isolando-o do ambiente externo para reduzir a penetração de O2 e a evaporação média.
Use uma lâmpada macro e toda a imagem em 60 vezes, 100 vezes lente objetiva com alta abertura numélica para tirar imagem. Para observações vivas, o microscópio deve ser equipado com uma incubadora para manter as condições necessárias para as células, incluindo bater na mesa óptica, e a lente para passar de 37 Centígrados, uma câmara fechada foi fornecimento de CO2 e suporte ao nível de umidade. Coloque a folha confocal com as células no suporte do microscópio antes da imagem.
Certifique-se de que o prato e a câmera estão bem ligados ao suporte para evitar a deriva enquanto tira imagens. Definindo os parâmetros de imagem. Escolha os baixos valores de exposição, uma vez que o slide induz danos às células, reage com espaços de oxigênio.
Para estudar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos da pele humana, selecionamos uma exposição de 300 milissegundos. Concentre-se no objeto de interesse. Para imagens de longo prazo, lapso de tempo, o sistema automático de estabilização de foco, sistema de foco perfeito é necessário, uma vez que pode haver uma mudança ao longo do eixo definido, e o objeto de interesse estará, portanto, fora de foco.
Escolha as condições de imagem ideais, dependendo da fotosensibilidade da célula e da taxa de desbotamento cromado do sinalizador. Uma vez que os microtúbulos são estruturas altamente dinâmicas, são razoavelmente curtos tempo, por sua vez, pode ser selecionado, e a taxa de quadros deve ser suficientemente alta. Para investigar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos da pele, utilizamos uma frequência de um quadro por segundo, por três, cinco minutos.
Ao selecionar o próximo objeto para obter imagem, afaste-se da área já imagemizada, já que sob a influência da luz, há uma foto-sangramento decorrido. Como usamos uma frequência de imagem relativamente alta, o obturador não fechou entre as imagens, e a lâmpada estava atrasada durante todo o período de imagem, que está desaparecendo. Escolha os vídeos ideais para estudar a dinâmica do microtúbulo visualmente, levando em conta a qualidade da transfecção, a qualidade das imagens dos microtúbulos, a relação sinal-ruído ideal e a ausência de deriva da célula analisada.
Use os vídeos selecionados para estudar a dinâmica de microtúbulos plus-ends, amarrando-os no programa Fiji. O passo mais crítico do protocolo é a transfecção, garantindo expressão proteica suficiente. Uma boa relação sinal-ruído, sem fotobleaching de microtúbulos, e ausência de drifting celular são críticos para a imagem.
A visualização in vivo da dinâmica dos microtúbulos fornece informações vitais sobre as propriedades da caça mutante. Nosso protocolo pode ser aplicado a estudos de outras doenças, cuja patologia implica propriedades dinâmicas do citoesqueleto.
