La malattia di Huntington, MH, è una patologia neurodegenerativa incurabile causata da una mutazione nel gene che codifica per la proteina huntingtina. L'huntingtina è principalmente associata a vescicole e microtubuli e probabilmente coinvolta nei processi di trasporto dipendenti dai microtubuli. Per studiare l'influenza dell'huntingtina mutante sul dinamismo dei microtubuli, abbiamo utilizzato la visualizzazione in vivo della proteina EB3, che regola le proprietà dinamiche dei microtubuli piegando e stabilizzando i plus-end in crescita.
Per caricare EB3 marcato fluorescentemente nei fibroblasti della pelle umana, abbiamo applicato la trasfezione del plasmide. Abbiamo usato la coltura primaria dei fibroblasti per ottenere dalla biopsia cutanea del paziente EB3 per questo studio. Consegnare la biopsia al laboratorio entro poche ore in mezzo DMEM, integrato con 15 microgrammi per millilitro di penicillina e 50 unità per millilitro di streptomicina.
Posizionare il tessuto della biopsia in una capsula di Petri di sei centimetri, insieme a una piccola quantità di mezzo. Usando un bisturi sterile, tagliare il campione di biopsia in pezzi di circa 0,5-un millimetro. Metti uno, due, frammenti ottenuti in una capsula di Petri di 3,5 centimetri e posiziona una copertura sterile sui pezzi della biopsia.
Aggiungere lentamente 1,5 millilitri di un mezzo di crescita. Fibra di coltura nel mezzo di crescita in un incubatore a CO2, in 5% CO2 che è sette centigradi, 80% di umidità. Dopo quattro, sette giorni, prima i cheratinociti, poi i fibroblasti iniziano a migrare dal tessuto al fondo del piatto.
Coltivazione cellulare. Per la visualizzazione della trasfezione, devono essere utilizzati piatti confocali in vetro, piatti confocali. Coprire il fondo del piatto con una soluzione di gelatina autoclavata allo 0,1% preparata in acqua distillata.
Incubare per 15 minuti. Preparare il mezzo culturale. Mescolare accuratamente, conservare alto a più 4 gradi centigradi.
Riscaldare il mezzo a più 37 gradi centigradi, prima di aggiungere alle cellule. Valutare la coltura al microscopio. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con un DPBS sterile.
Aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina 0,25% preriscaldata alle cellule. Controllare le cellule al microscopio se si staccano completamente dal substrato. Disattivare la tripsina con un millilitro del terreno di coltura.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 200 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante, risospesciare la tavolozza cellulare in un millilitro del terreno di coltura.
Contare il numero di cella. Calcolare il numero richiesto di celle. De-seminarli con una densità da otto a 15, moltiplicata per 10 alla potenza di tre, passata di un centimetro.
Questo è panned in millilitri del mezzo di coltura. Rimuovere la soluzione di gelatina dal piatto di coltura preparato per l'inoculazione e aggiungere immediatamente due millilitri della sospensione cellulare. Coltivare fibroblasti a più 37 gradi centigradi in un incubatore a CO2.
Aggiorna il mezzo ogni due, quattro giorni. Per gli esperimenti, usa le celle di quattro, 11 passaggi. Al momento della trasfezione, la confluenza non deve essere superiore al 70%, 80% Sostituire il terreno di coltura con uno fresco 24 ore prima della trasfezione.
Preparare un complesso DNA-lipidico, basato sull'area e sulla densità della semina cellulare. È stato utilizzato l'agente di trasfezione liposomiale e la densità della semina cellulare di uno, moltiplicata per 10 alla potenza di quattro cellule, passata di un centimetro. Aggiungere tre microlitri di reagente commerciale a 125 microlitri di Opti-MEM, senza antibiotico.
Senza toccare le pareti del tubo, risospesci delicatamente. DNA plasmidico diluito, GFP-EB3, aggiungendo un microgrammo di DNA plasmidico a 125 microlitri di OptiMEM. Risospendare delicatamente.
Aggiungere DNA plasmidico diluito a ciascun tubo di reagente di trasfezione diluito, rapporto uno a uno. Incubare per 30 minuti. Aggiungere il complesso lipidico del DNA alla capsula di Petri di sei centimetri con le cellule.
Mescolare con un'altalena cruciforme per 30 secondi. Incubare le cellule con un agente di trasfezione per 24 ore, quindi cambiare il mezzo in uno fresco. Analizza l'efficienza dopo l'ispezione in 24 e 48 ore.
Preparazione per l'imaging. Prima dell'imaging dal vivo delle cellule, cambiare il terreno di coltura in un mezzo senza colorante indicatore PH per ridurre l'autofluorescenza. Applicare con attenzione l'olio minerale alla fase della cellula media per coprire completamente il mezzo, isolandolo dall'ambiente esterno per ridurre la penetrazione di O2 e l'evaporazione media.
Usa una lampada macro e tutte le immagini in un obiettivo 60 volte, 100 volte con apertura numerica elevata per scattare un'immagine. Per le osservazioni in viva, il microscopio deve essere dotato di un incubatore per mantenere le condizioni necessarie per le cellule, compreso il colpire la tavola ottica, e la lente per passare 37 gradi centigradi, una camera chiusa era l'alimentazione di CO2 e il supporto del livello di umidità. Posizionare il piatto confocale con le cellule nel supporto del microscopio prima dell'imaging.
Assicurarsi che la parabola e la fotocamera siano saldamente attaccate al supporto per evitare la deriva durante lo scatto di immagini. Impostazione dei parametri di imaging. Scegli i bassi valori di esposizione, poiché il vetrino induce il danneggiamento delle cellule, reagisce con gli spazi di ossigeno.
Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti della pelle umana, abbiamo selezionato un'esposizione di 300 millisecondi. Concentrati sull'oggetto di interesse. Per l'imaging time-lapse a lungo termine, è necessario il sistema di stabilizzazione automatica della messa a fuoco, il sistema di messa a fuoco perfetta, poiché potrebbe esserci uno spostamento lungo l'asse impostato e l'oggetto di interesse sarà quindi sfocato.
Scegli le condizioni di imaging ottimali, a seconda della fotosensibilità della cella e della velocità di sbiadimento del cromo flare. Poiché i microtubuli sono strutture altamente dinamiche, è possibile selezionare un tempo ragionevolmente breve a sua volta e il frame rate deve essere sufficientemente alto. Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei, abbiamo usato una frequenza di un fotogramma al secondo, per tre, cinque minuti.
Quando si seleziona l'oggetto successivo per ottenere l'immagine, allontanarsi dall'area già ripresa, poiché sotto l'influenza della luce, c'è un foto-sanguinamento elapsable. Poiché abbiamo utilizzato una frequenza di imaging relativamente elevata, l'otturatore non si è chiuso tra le immagini e la lampada era in ritardo per l'intero periodo di imaging, che sta svanendo aumentando. Scegli i video ottimali per studiare visivamente la dinamica dei microtubuli, tenendo conto della qualità della trasfezione, della qualità delle immagini dei microtubuli, del rapporto segnale-rumore ottimale e dell'assenza di deriva della cellula analizzata.
Usa i video selezionati per studiare le dinamiche dei microtubuli plus-ends, travestendoli nel programma Fiji. Il passo più critico nel protocollo è la trasfezione, garantendo una sufficiente espressione proteica. Un buon rapporto segnale-rumore, nessuna fotosbiancamento dei microtubuli e l'assenza di deriva cellulare sono fondamentali per l'imaging.
La visualizzazione in vivo della dinamica dei microtubuli fornisce informazioni vitali sulle proprietà dell'huntingtina mutante. Il nostro protocollo può essere applicato a studi di altre malattie, la cui patologia implica proprietà dinamiche del citoscheletro.
