Huntington hastalığı, HD, gen kodlama huntingtin proteininde bir mutasyonun neden olduğu tedavi edilemez, nörodejeneratif bir patolojidir. Huntingtin öncelikle veziklinler ve mikrotübüllerle ilişkilidir ve muhtemelen mikrotübüle bağımlı taşıma süreçlerinde yer almaktadır. Mutant huntingtin'in mikrotübüllerin dinamizmi üzerindeki etkisini incelemek için, büyüyen artı uçları bükerek ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerini düzenleyen EB3 proteininin in vivo görselleştirmesini kullandık.
Floresan etiketli EB3'ü insan derisi fibroblastlarına yüklemek için plazmid transfeksiyon uyguladık. Bu çalışma için EB3 hastasının cilt biyopsisinden elde etmek için primer fibroblast kültürünü kullandık. Biyopsiyi mililitre penisilin başına 15 mikrogram ve mililitre streptomisinin mililitresi ile desteklenmiş DMEM ortamında birkaç saat içinde laboratuvara teslim edin.
Biyopsi dokusunu az miktarda ortamla birlikte altı santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir neşter kullanarak biyopsi örneğini yaklaşık 0,5 ila bir milimetre büyüklüğünde parçalara ayırın. Bir, iki, elde edilen parçaları 3,5 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve biyopsi parçalarının üzerine steril bir kapak kayması yerleştirin.
Yavaşça bir büyüme ortamının 1,5 mililitresini ekleyin. Bir CO2 inkübatöründe büyüme ortamında kültür fiberblastları, yedi Santigrat,% 80 nem olan% 5 CO2'de. Dört, yedi gün sonra, önce keratinositler, daha sonra fibroblastlar dokudan yemeğin dibine göç etmeye başlar.
Hücre ekimi. Transfeksiyon görselleştirme için cam konfokal tabak yemekleri, konfokal yemekler kullanılmalıdır. Tabak tabanını damıtılmış suda hazırlanan otomatik kapatılmış%0,1 jelatin çözeltisi ile örtün.
15 dakika kuluçkaya yatır. Kültür ortamını hazırlayın. İyice karıştırın, artı 4 Santigrat'ta uzun süre saklayın.
Hücrelere eklemeden önce orta ila artı 37 Santigrat ısıtın. Kültürü mikroskop altında değerlendirin. Ortamı çıkarın ve hücreleri steril bir DPBS ile yıkayın.
Hücrelere bir mililitre önceden ısıtılmış %0,25 tripsin çözeltisi ekleyin. Mikroskop altındaki hücreleri, alt tabakadan tamamen ayrılırlarsa kontrol edin. Tripini kültür ortamının bir mililitresiyle devre dışı bırak.
Hücre süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü 200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Üstnatant kaldırın, hücre paletini kültür ortamının bir mililitresinde yeniden diriltin.
Cep telefonu numarasını say. Gerekli hücre sayısını hesaplayın. Sekiz ila 15 yoğunluklu, 10 ile üç gücüyle çarpılmış, bir santimetre ile geçirilen tohumlarını çözün.
Bu, kültür ortamının mililitrelerine dönüştürülür. Jelatin çözeltisini aşılama için hazırlanan kültür çanaktan çıkarın ve hemen iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Co2 inkübatörde artı 37 Santigrat'ta fibroblast yetiştirin.
Ortamı her iki, dört günde bir yenileyin. Deneyler için dört, 11 pasajlık hücreleri kullanın. Transfeksiyon sırasında, izdiham en fazla 70, % 80 olmalıdır Transfection'dan 24 saat önce kültür ortamını taze bir ortamla değiştirin.
Hücre tohumlama alanına ve yoğunluğuna göre bir DNA-lipid kompleksi hazırlayın. Lipozomal transfeksiyon ajanı ve bir santimetre ile geçirilen dört hücrenin gücüne 10 ile çarpılan bir hücre tohumlama yoğunluğu kullanıldı. 125 mikrolitre Opti-MEM'e antibiyotik içermeyen üç mikrolitre ticari reaktif ekleyin.
Tüp duvarlarına dokunmadan, yavaşça yeniden diriltin. Plazmid DNA'sını seyreltin, GFP-EB3, 125 mikrolitre OptiMEM'e plazmid DNA'sının bir mikrogramını ekleyerek. Yavaşça yeniden dirilt.
Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin her tüpüne bire bir oran olmak üzere seyreltilmiş plazmid DNA ekleyin. 30 dakika kuluçkaya yatır. DNA lipid kompleksini hücrelerle altı santimetre petri kabına ekleyin.
30 saniye boyunca bir haç teli ile karıştırın. Hücreleri 24 saat boyunca bir transfeksiyon ajanı ile kuluçkaya yatırın, ardından ortamı taze olana değiştirin. 24 ve 48 saat içinde muayeneden sonra verimliliği analiz edin.
Görüntülemeye hazırlanıyoruz. Hücrelerin canlı görüntülenmesinden önce, otofluoresansı azaltmak için kültür ortamını PH gösterge boyası olmayan bir ortama değiştirin. Orta hücre fazını tamamen örtmek için mineral yağı dikkatlice uygulayın, O2 penetrasyonunu ve orta buharlaşmayı azaltmak için dış ortamdan izole edin.
Görüntü almak için yüksek rakamlı diyaframa sahip 60 kat, 100 kat objektif lenste bir makro lamba ve tüm görüntü kullanın. Viva gözlemlerinde, mikroskop, optik masaya vurmak da dahil olmak üzere hücreler için gerekli koşulları korumak için bir inkübatör ve lensin 37 Santigrat'ı geçmesi için bir inkübatör ile donatılmalıdır, kapalı bir oda CO2 kaynağıydı ve nem seviyesi destek. Konfokal kabı görüntülemeden önce mikroskop tutucusuna hücrelerle birlikte yerleştirin.
Görüntü çekerken sürüklenmeyi önlemek için çanağın ve kameranın tutucuya güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Görüntüleme parametreleri ayarlıyor. Slayt hücreye zarar verdiğinden, oksijen boşluklarıyla reaksiyona neden olduğundan, düşük pozlama değerlerini seçin.
İnsan derisi fibroblastlarındaki mikrotübüllerin dinamiklerini incelemek için 300 milisaniyelik bir maruziyet seçtik. İlgi çekici nesneye odaklanın. Uzun süreli, hızlandırılmış görüntüleme için otomatik odak sabitleme sistemi, mükemmel odak sistemi gereklidir, çünkü ayarlanan eksen boyunca bir kayma olabilir ve ilgi çekici nesne böylece odak dışında kalacaktır.
Hücrenin ışığa duyarlılığına ve parlama krom solma hızına bağlı olarak en uygun görüntüleme koşullarını seçin. Mikrotübüller son derece dinamik yapılar olduğundan, makul derecede kısa bir süre seçilebilir ve kare hızı yeterince yüksek olmalıdır. Cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerini araştırmak için üç, beş dakika boyunca saniyede bir kare frekans kullandık.
Görüntü almak için bir sonraki nesneyi seçerken, zaten görüntülenmiş alandan uzaklaşın, çünkü ışığın etkisi altında, geçilebilir bir fotoğraf kanaması vardır. Nispeten yüksek bir görüntüleme frekansı kullandığımız için, deklanşör görüntüler arasında kapanmadı ve lamba tüm görüntüleme süresi boyunca geç kaldı, bu da soluyor. Transeksiyon kalitesini, mikrotübüllerin görüntülerinin kalitesini, optimum sinyal-gürültü oranını ve analiz edilen hücrenin sürüklenmesinin yokluğunu göz önünde bulundurarak mikrotübül dinamiklerini görsel olarak incelemek için en uygun videoları seçin.
Seçilen videoları, Fiji programında yerle bir ederek mikrotübülleri artı uçlu dinamikleri incelemek için kullanın. Protokoldeki en kritik adım transfeksiyondur ve yeterli protein ekspresyonunu sağlar. İyi sinyal-gürültü oranı, mikrotübüllerin fotobleaching olmaması ve hücre sürüklenmesinin olmaması görüntüleme için kritik öneme sahiptir.
Mikrotübül dinamiklerinin in vivo görselleştirilmesi, mutant huntingtin özellikleri hakkında hayati bilgiler sağlar. Protokolümüz, patolojisi sitoskeletonun dinamik özelliklerini ima eden diğer hastalıkların çalışmalarına uygulanabilir.
