Die Huntington-Krankheit, die Huntington-Krankheit, ist eine unheilbare, neurodegenerative Pathologie, die durch eine Mutation im Gen verursacht wird, das für das Huntingtin-Protein kodiert. Das Huntingtin ist in erster Linie mit Vesikeln und Mikrotubuli assoziiert und wahrscheinlich an mikrotubuliabhängigen Transportprozessen beteiligt. Um den Einfluss von mutiertem Huntingtin auf die Dynamik von Mikrotubuli zu untersuchen, verwendeten wir die In-vivo-Visualisierung des EB3-Proteins, das die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli reguliert, indem es die wachsenden Plus-Enden biegt und stabilisiert.
Um fluoreszierend markiertes EB3 in menschliche Hautfibroblasten zu laden, haben wir Plasmidtransfektion angewendet. Wir verwendeten die primäre Fibroblastenkultur, um aus der Hautbiopsie des EB3-Patienten für diese Studie zu gewinnen. Liefern Sie die Biopsie innerhalb weniger Stunden in DMEM-Medium an das Labor, ergänzt mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin und 50 Einheiten pro Milliliter Streptomycin.
Legen Sie Biopsiegewebe in eine sechs Zentimeter Petrischale, zusammen mit einer kleinen Menge Medium. Schneiden Sie die Biopsieprobe mit einem sterilen Skalpell in etwa 0,5 bis einen Millimeter große Stücke. Legen Sie ein, zwei erhaltene Fragmente in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale und legen Sie einen sterilen Deckschleim über die Biopsiestücke.
Fügen Sie langsam 1,5 Milliliter eines Wachstumsmediums hinzu. Kulturfaserblasten im Wachstumsmedium in einem CO2-Inkubator, in 5% CO2, das sind sieben Grad Celsius, 80% Luftfeuchtigkeit. Nach vier, sieben Tagen beginnen zuerst Keratinozyten, dann Fibroblasten vom Gewebe zum Boden der Schale zu wandern.
Zellkultivierung. Für die Visualisierung der Transfektion sollten konfokale Glasplattenschalen, konfokale Gerichte verwendet werden. Den Schalenboden mit autoklavierter 0,1%iger Gelatinelösung bedecken, die in Destillatwasser zubereitet wird.
15 Minuten inkubieren. Bereiten Sie das Kulturmedium vor. Gründlich mischen, hoch bei plus 4 Grad Celsius lagern.
Erwärmen Sie das Medium auf plus 37 Grad Celsius, bevor Sie es zu den Zellen hinzufügen. Beurteilen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit einem sterilen DPBS.
Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmte 0,25% Trypsinlösung zu den Zellen hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, ob sie sich vollständig vom Substrat lösen. Deaktivieren Sie Trypsin mit einem Milliliter des Kulturmediums.
Die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellpalette in einem Milliliter des Kulturmediums.
Zählen Sie die Zellennummer. Berechnen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen. Entkernen Sie sie mit einer Dichte von acht bis 15, multipliziert mit 10 hoch drei, um einen Zentimeter passiert.
Diese wird in Milliliter des Kulturmediums geschwenkt. Nehmen Sie die Gelatinelösung aus der für die Impfung vorbereiteten Kulturschale und fügen Sie sofort zwei Milliliter der Zellsuspension hinzu. Kultivieren Sie Fibroblasten mit plus 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator.
Aktualisieren Sie das Medium alle zwei, vier Tage. Verwenden Sie für Experimente die Zellen von vier, 11 Passagen. Zum Zeitpunkt der Transfektion sollte der Zusammenfluss nicht mehr als 70, 80% betragen Ersetzen Sie das Kulturmedium 24 Stunden vor der Transfektion durch ein frisches.
Bereiten Sie einen DNA-Lipid-Komplex vor, der auf der Fläche und Dichte der Zellaussaat basiert. Liposomales Transfektionsmittel und die Dichte der Zellaussaat von eins, multipliziert mit 10 hoch vier Zellen, wurde um einen Zentimeter überschritten. Fügen Sie drei Mikroliter kommerzielles Reagenz zu 125 Mikrolitern Opti-MEM hinzu, die kein Antibiotikum enthalten.
Ohne die Rohrwände zu berühren, vorsichtig resuspendieren. Verdünnte Plasmid-DNA, GFP-EB3, wobei ein Mikrogramm der Plasmid-DNA zu 125 Mikrolitern OptiMEM hinzugefügt wird. Vorsichtig resuspendieren.
Fügen Sie verdünnte Plasmid-DNA zu jedem Röhrchen verdünnter Transfektionsreagenz hinzu, ein zu eins Verhältnis. 30 Minuten inkubieren. Fügen Sie den DNA-Lipidkomplex der sechs Zentimeter langen Petrischale mit Zellen hinzu.
Mit einem kreuzförmigen Schwung für 30 Sekunden mischen. Inkubieren Sie Zellen mit einem Transfektionsmittel für 24 Stunden und wechseln Sie dann das Medium in ein frisches. Analysieren Sie die Effizienz nach der Inspektion in 24 und 48 Stunden.
Vorbereiten der Bildgebung. Vor der Live-Bildgebung von Zellen ändern Sie das Kulturmedium in ein Medium ohne PH-Indikatorfarbstoff, um die Autofluoreszenz zu reduzieren. Tragen Sie Mineralöl vorsichtig auf die mittlere Zellphase auf, um das Medium vollständig abzudecken, und isolieren Sie es von der äußeren Umgebung, um das Eindringen von O2 und die Verdampfung des Mediums zu reduzieren.
Verwenden Sie eine Makrolampe und das gesamte Bild in einem 60-fachen, 100-fachen Objektiv mit hoher Ziffernöffnung, um ein Bild aufzunehmen. Denn in der viva-Beobachtung muss das Mikroskop mit einem Inkubator ausgestattet sein, um die notwendigen Bedingungen für die Zellen aufrechtzuerhalten, einschließlich des Schlagens auf den Sehtisch und der Linse, um 37 Grad Celsius zu passieren, eine geschlossene Kammer war CO2-Versorgung und Feuchtigkeitsunterstützung. Legen Sie die konfokale Schale mit den Zellen vor der Bildgebung in den Halter des Mikroskops.
Stellen Sie sicher, dass die Schüssel und die Kamera sicher an der Halterung befestigt sind, um ein Driften während der Aufnahme von Bildern zu vermeiden. Festlegen der Imaging-Parameter. Wählen Sie die niedrigen Expositionswerte, da der Objektträger zellschädigend induziert, mit Sauerstoffräumen reagiert.
Um die Dynamik von Mikrotubuli in menschlichen Hautfibroblasten zu untersuchen, wählten wir eine 300-Millisekunden-Exposition. Konzentrieren Sie sich auf das Objekt von Interesse. Für Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung, das automatische Fokusstabilisierungssystem, ist ein perfektes Fokussystem erforderlich, da es zu einer Verschiebung entlang der eingestellten Achse kommen kann und das Objekt von Interesse somit unscharf ist.
Wählen Sie die optimalen Bildgebungsbedingungen, abhängig von der Lichtempfindlichkeit der Zelle und der Geschwindigkeit des Verblassens des Flare-Chroms. Da mikrotubuli hochdynamische Strukturen sind, können wiederum relativ kurze Zeit gewählt werden, und die Bildrate muss ausreichend hoch sein. Um die Mikrotubuli-Dynamik in Hautfibroblasten zu untersuchen, verwendeten wir eine Frequenz von einem Bild pro Sekunde für drei, fünf Minuten.
Wenn Sie das nächste Objekt auswählen, um ein Bild zu erhalten, entfernen Sie sich von dem bereits abgebildeten Bereich, da unter dem Einfluss von Licht eine verstrichene Fotoblutung auftritt. Da wir eine relativ hohe Abbildungsfrequenz verwendet haben, schloss sich der Verschluss zwischen den Bildern nicht, und die Lampe kam während der gesamten Bildgebungsdauer zu spät, was zunehmend verblasst. Wählen Sie die optimalen Videos für die visuelle Untersuchung der Mikrotubulidynamik unter Berücksichtigung der Qualität der Transfektion, der Qualität der Bilder der Mikrotubuli, des optimalen Signal-Rausch-Verhältnisses und der Abwesenheit von Drift der analysierten Zelle.
Verwenden Sie die ausgewählten Videos, um die Dynamik der Mikrotubuli plus Enden zu untersuchen, indem Sie sie im Fidschi-Programm traversieren. Der kritischste Schritt im Protokoll ist die Transfektion, die eine ausreichende Proteinexpression gewährleistet. Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis, kein Photobleichen von Mikrotubuli und das Fehlen von Zelldrift sind entscheidend für die Bildgebung.
Die In-vivo-Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik liefert wichtige Informationen über die Eigenschaften von mutiertem Huntingtin. Unser Protokoll kann auf Studien anderer Krankheiten angewendet werden, deren Pathologie dynamische Eigenschaften des Zytoskeletts impliziert.
