פרוטוקול זה מאפשר לנו לתרבת מיקרוגליה בתנאים המחקים באופן הדוק את מאפייני ה- in vivo. באמצעות טכנולוגיית מיון תאים מגנטיים, הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לעורר מיקרוגליה רק יומיים במבחנה, מבלי להשתמש בסרום כלשהו במדיום התרבית. כדי להתחיל, להשתמש מספריים קטנים כדי לחתוך את העור מן הצוואר אל האף, בעקבות תפר sagittal של 15 עד 20 מ"מ.
הכנס את הקצוות עם מגנום foramen במקביל לגולגולת. חותכים מכל צד לעיניים. חותכים בין העיניים עם מספריים קטנים כדי לנתק את הגולגולת והמוח מהראש.
בעזרת שני מלקחיים, תפסו את הגולגולת קרוב לנורות חוש הריח, וקרעו בזהירות את הגולגולת. בעזרת סכין גילוח, הסר את המוח הקטן ואת הנורה olfactive, לחתוך את המוח לשני חלקים. מניחים את חלקי המוח בצלחת פטרי המכילה 40 מיליליטר של HBSS ללא סידן ומגנזיום.
הכינו תערובת דיסוציאציה לפי טבלה זו. העבירו 12 חלקי מוח לצינור C במשקל כולל של 1.2 גרם לכל צינור דיסוציאציה. לאחר מכן מניחים צינורות C על הדיסוציאציה עם חימום.
הפעל את תוכנית NTDK הממוטבת בדיסוציאציה. צנטריפוגה למשך 20 שניות. השלם את הדיסוציאציה המכנית על ידי פיפטינג שלוש פעמים.
מעבירים את התאים לארבעה צינורות 15 מיליליטר עם מסננים מחוברים. שוטפים את המסננים עם 10 מיליליטר של HBSS עם סידן ומגנזיום. צנטריפוגה במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant עם פיפטה 10 מיליליטר.
בזהירות להוסיף 10 מיליליטר של HBSS עם סידן ומגנזיום, ולהשעות מחדש את הכדור. שוב, צנטריפוגה ולהסיר את supernatant. להשעות מחדש את הכדור עם שישה מיליליטר של חיץ מיון.
חזור על הצנטריפוגה והשלך את הסופרנטנט. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תמיסת מיקרובאד CD11b ומדגרים את הצינורות במשך 15 עד 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להשעות מחדש את הכדור עם שישה מיליליטר של חיץ מיון.
חזור על הצנטריפוגה והשעה מחדש את הכדור עם שמונה מיליליטר של חיץ מיון. לאחר מכן, בצע את תוכנית Possel על המפריד כדי להכין שמונה עמודות. העבר את התאים דרך העמודה על-ידי הוספת מיליליטר אחד של השעיית תאים בכל פעם.
עם מיליליטר אחד של חיץ מיון, תאים חיוביים CD11b על צלחת elution סטרילית. איחד את התאים בצינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה ולהשעות מחדש את הכדור עם 10 מיליליטר של מיקרוגליה קר בינוני.
ספירת התאים החיוביים ל-CD11b. להשעות מחדש את התאים במדיום מיקרוגליה קר כדי לקבל ריכוז סופי של 650, 000 עד 700, 000 תאים למיליליטר. מחלקים את ההשעיה בלוחות תרבית תאים.
לדגום את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, להחליף את המדיום עם מדיום microglia מחומם מראש, ולחזור על הדגירה לילה. לעורר את התאים לפני שלב זה, ולבצע בדיקה phagocytic במהלך שלוש השעות האחרונות של הגירוי.
חשב את מספר החרוזים לפי טבלה זו ביחס של 50 חרוזים לתא. מכינים את תערובת החרוזים. לדגור את הצינור במשך שעה אחת באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
מערבולת כל 10 דקות. לכל באר, מוסיפים את הנפח המחושב של תמיסת החרוזים ומדגרים במשך שלוש שעות. באמצעות גישה זו, הפעילות הפאגוציטית של מיקרוגליה הוערכה לאחר גירוי על ידי גורמים מעודדי דלקת, כגון אינטרלוקין-1 בטא, בתוספת אינטרפרון גמא, או ליפופוליסכרידים.
לאחר גירוי במשך שש עד 24 שעות, חרוזי מיקרוגליה פלואורסצנטיים של Cy3 נותחו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר שש שעות, מיקרוגליה מתחילה לקבל חרוזי פאגוציטים Cy3 רק במצב אינטרלוקין-1 בטא בתוספת אינטרפרון גמא. לאחר 24 שעות, חלה עלייה של Cy3 פלואורסצנטיות לשני סוגי הגירוי, מה שמדגיש פעילות פאגוציטית מוגברת.
טוהר התרבית המיקרוגליאלית הועלה על ידי ציטומטריה של זרימה, שהראתה עלייה בכדאיות התאים לאחר המיון. באמצעות ציטומטריה של זרימה וסמני אוכלוסיית תאי RT-qPCR נותחו לפני ואחרי מיון תאים חיוביים ל-CD11b ממוחות של עכברים ביום השמיני שלאחר הלידה. ניתוחים אלה הבחינו בין אוכלוסיות שונות של תאי מוח, כגון CX3CR135 עבור מיקרוגליה, O4, או OLIG2 עבור אוליגודנדרוציטים, NeuN, או סינפטופיזין, עבור נוירונים, ו-ACSA-2, או GFAP עבור אסטרוציטים.
לאחר מיון תאים באמצעות נוגדן CD11b, התקבלו רק מיקרוגליה. חשוב לבצע פיפטה עדינה מאוד בעת הוספת המתלים לעמודה כדי למנוע סתימה ומניעת מוות מכני של תאים. לאחר שיטה זו, פרוטאומיקה תעתיקית, כגון דם מערבי, או Luminex, ואפילו אימונוכימיה ניתן לבצע על מנת לראות את ההשפעה של גירוי microglial.
