Ce protocole nous permet de cultiver la microglie dans des conditions qui imitent étroitement les caractéristiques in vivo. En utilisant la technologie de tri cellulaire magnétique, notre protocole nous permet de stimuler la microglie seulement deux jours in vitro, sans utiliser de sérum dans le milieu de culture. Pour commencer, utilisez de petits ciseaux pour couper la peau du cou au nez, en suivant la suture sagittale de 15 à 20 millimètres.
Insérez les pointes avec le foramen magnum parallèle au crâne. Couper de chaque côté aux yeux. Coupez entre les yeux avec de petits ciseaux pour détacher le crâne et le cerveau de la tête.
Avec deux pinces, saisissez le crâne près des bulbes olfactifs et déchirez soigneusement le crâne. Avec une lame de rasoir, retirez le cervelet et le bulbe olfactif et coupez le cerveau en deux morceaux. Placez les morceaux de cerveau dans une boîte de Petri contenant 40 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium.
Préparer le mélange de dissociation selon ce tableau. Transférer 12 morceaux de cerveau dans un tube C pour un poids total de 1,2 gramme par tube de dissociation. Placez ensuite les tubes C sur le dissociateur avec chauffage.
Démarrez le programme NTDK optimisé dans le dissociateur. Centrifuger pendant 20 secondes. Complétez la dissociation mécanique en pipetant trois fois.
Transférer les cellules dans quatre tubes de 15 millilitres munis de crépines. Rincez les passoires avec 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium. Centrifuger pendant 10 minutes et retirer le surnageant avec une pipette de 10 millilitres.
Ajoutez soigneusement 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium et remettez la pastille en suspension. Encore une fois, centrifuger et retirer le surnageant. Re-suspendre la pastille avec six millilitres de tampon de tri.
Répétez la centrifugation et jetez le surnageant. Ajoutez ensuite 200 microlitres de solution de microbilles CD11b et incuber les tubes pendant 15 à 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, remettre en suspension la pastille avec six millilitres de tampon de tri.
Répétez la centrifugation et remettez la pastille en suspension avec huit millilitres de tampon de tri. Ensuite, suivez le programme Possel sur le séparateur pour préparer huit colonnes. Passez les cellules à travers la colonne en ajoutant un millilitre de suspension cellulaire à la fois.
Avec un millilitre de tampon de tri, éluer les cellules CD11b positives sur une plaque d’élution stérile. Regroupez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger et remettre en suspension la pastille avec 10 millilitres de milieu microglial froid.
Comptez les cellules CD11b positives. Re-suspendre les cellules dans un milieu microglial froid pour obtenir une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules par millilitre. Distribuer la suspension dans des plaques de culture cellulaire.
Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu microglial préchauffé et répétez l’incubation pendant la nuit. Stimuler les cellules avant cette étape et effectuer un dosage phagocytaire pendant les trois dernières heures de la stimulation.
Calculez le nombre de perles selon ce tableau à un ratio de 50 perles par cellule. Préparez le mélange de perles. Incuber le tube pendant une heure au bain-marie à 37 degrés Celsius.
Vortex toutes les 10 minutes. À chaque puits, ajoutez le volume calculé de la solution de billes et incuber pendant trois heures. En utilisant cette approche, l’activité phagocytaire de la microglie a été évaluée après stimulation par des facteurs pro-inflammatoires, tels que l’interleukine-1 bêta, plus l’interféron gamma, ou les lipopolysaccharides.
Après une stimulation de six à 24 heures, les billes fluorescentes de microglie Cy3 ont été analysées au microscope confocal. Après six heures, la microglie commence à phagocyter les billes Cy3 uniquement dans des conditions d’interleukine-1 bêta plus interféron gamma. Après 24 heures, il y avait une augmentation de la fluorescence Cy3 pour les deux types de stimulation, soulignant une activité phagocytaire accrue.
La pureté de la culture microgliale a été augmentée par cytométrie en flux, qui a montré une augmentation de la viabilité cellulaire après le tri. À l’aide de la cytométrie de flux et des marqueurs de population de cellules RT-qPCR, on a analysé avant et après le tri des cellules CD11b positives du cerveau de souris au huitième jour postnatal. Ces analyses ont distingué diverses populations de cellules cérébrales, telles que CX3CR135 pour la microglie, O4 ou OLIG2 pour les oligodendrocytes, NeuN ou synaptophysine, pour les neurones, et ACSA-2, ou GFAP pour les astrocytes.
Après tri cellulaire à l’aide d’anticorps CD11b, seules les microglies ont été obtenues. Il est important de pipeter très doucement tout en ajoutant la suspension à la colonne pour éviter le colmatage et éviter la mort mécanique des cellules. Après cette méthode, la protéomique transcriptomique, comme le sang occidental, ou Luminex, et même l’immunochimie peuvent être effectuées afin de voir l’effet de la stimulation microgliale.
