Bu protokol, mikroglia'yı in vivo özellikleri yakından taklit eden koşullarda kültürlememizi sağlar. Manyetik hücre sıralama teknolojisini kullanarak, protokolümüz kültür ortamında herhangi bir serum kullanmadan mikroglia'yı sadece iki gün in vitro olarak uyarmamızı sağlar. Başlamak için, 15 ila 20 milimetrelik sagital sütürü takiben, cildi boyundan buruna kesmek için küçük makas kullanın.
Uçları kafatasına paralel foramen magnum ile yerleştirin. Her iki taraftan gözlere kadar kesin. Kafatasını ve beyni kafadan ayırmak için gözler arasında küçük makasla kesin.
İki forseps ile kafatasını koku alma ampullerine yakın tutun ve kafatasını dikkatlice yırtın. Bir tıraş bıçağı ile beyincik ve olfaktif ampulü çıkarın ve beyni iki parçaya bölün. Beyin parçalarını kalsiyum ve magnezyum içermeyen 40 mililitre HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
Bu tabloya göre ayrışma karışımını hazırlayın. 12 beyin parçasını, ayrışma tüpü başına toplam 1.2 gram ağırlık için bir C tüpüne aktarın. Daha sonra C tüplerini ısıtıcı ile ayrıştırıcıya yerleştirin.
Optimize edilmiş NTDK programını dissosiyatörde başlatın. 20 saniye santrifüj. Üç kez pipetleme yaparak mekanik ayrışmayı tamamlayın.
Hücreleri, bağlı süzgeçlerle dört adet 15 mililitrelik tüpe aktarın. Süzgeçleri kalsiyum ve magnezyum ile 10 mililitre HBSS ile durulayın. 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı 10 mililitrelik bir pipetle çıkarın.
Kalsiyum ve magnezyum ile 10 mililitre HBSS ekleyin ve peleti tekrar askıya alın. Yine, süpernatanı santrifüj yapın ve çıkarın. Peleti altı mililitre ayıklama tamponu ile yeniden askıya alın.
Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. Daha sonra 200 mikrolitre CD11b mikroboncuk çözeltisi ekleyin ve tüpleri dört santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, peleti altı mililitre ayırma tamponu ile yeniden askıya alın.
Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve peleti sekiz mililitre ayırma tamponu ile yeniden askıya alın. Ardından, sekiz sütun hazırlamak için ayırıcıdaki Possel programını izleyin. Bir seferde bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri sütundan geçirin.
Bir mililitre ayıklama tamponu ile, CD11b-pozitif hücreleri steril bir elüsyon plakası üzerinde süzün. Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Peleti 10 mililitre soğuk mikroglia ortamı ile santrifüj yapın ve tekrar askıya alın.
CD11b-pozitif hücreleri sayın. Mililitre başına 650.000 ila 700.000 hücrelik bir son konsantrasyon elde etmek için hücreleri soğuk mikroglia ortamında tekrar askıya alın. Süspansiyonu hücre kültürü plakalarına dağıtın.
Plakaları gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ortamı önceden ısıtılmış mikroglia ortamı ile değiştirin ve gece boyunca inkübasyonu tekrarlayın. Bu adımdan önce hücreleri uyarın ve stimülasyonun son üç saati boyunca fagositik tahlil yapın.
Bu tabloya göre boncuk sayısını hücre başına 50 boncuk oranında hesaplayın. Boncuk karışımını hazırlayın. Tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin.
Her 10 dakikada bir vorteks. Her bir kuyucuğa, boncuk çözeltisinin hesaplanan hacmini ekleyin ve üç saat boyunca inkübe edin. Bu yaklaşımı kullanarak, mikroglia'nın fagositik aktivitesi, interlökin-1 beta, artı interferon gama veya lipopolisakkaritler gibi pro-inflamatuar faktörler tarafından stimülasyondan sonra değerlendirildi.
Altı ila 24 saat boyunca stimülasyondan sonra, floresan Cy3 mikroglia boncukları konfokal mikroskopla analiz edildi. Altı saat sonra, mikroglia sadece interlökin-1 beta artı interferon gama durumu altında Cy3 boncuklarını fagosit etmeye başlar. 24 saat sonra, her iki stimülasyon türü için de Cy3 floresansında bir artış oldu ve bu da fagositik aktivitenin arttığını vurguladı.
Mikroglial kültürün saflığı, sıralamadan sonra hücre canlılığında bir artış gösteren akış sitometrisi ile yükseltildi. Akış sitometrisi ve RT-qPCR hücre popülasyonu belirteçleri kullanılarak, doğum sonrası sekizinci günde farelerin beyinlerinden CD11b-pozitif hücrelerin ayrılmasından önce ve sonra analiz edildi. Bu analizler, mikroglia için CX3CR135, O4 veya oligodendrositler için OLIG2, nöronlar için NeuN veya sinaptofizin ve astrositler için ACSA-2 veya GFAP gibi çeşitli beyin hücresi popülasyonlarını ayırt etti.
CD11b antikoru kullanılarak hücre sıralama yapıldıktan sonra sadece mikroglia elde edildi. Tıkanmayı önlemek ve mekanik hücre ölümünü önlemek için süspansiyonu kolona eklerken çok nazikçe pipet uygulamak önemlidir. Bu yöntemden sonra, mikroglial stimülasyonun etkisini görmek için batı kanı veya Luminex gibi transkriptomik proteomikler ve hatta immünokimya yapılabilir.
