Este protocolo nos permite cultivar micróglias em condições que imitam de perto as características in vivo. Usando a tecnologia de classificação de células magnéticas, nosso protocolo nos permite estimular a micróglia apenas dois dias in vitro, sem usar nenhum soro no meio de cultura. Para começar, use uma pequena tesoura para cortar a pele do pescoço ao nariz, seguindo a sutura sagital de 15 a 20 milímetros.
Insira as pontas com o forame magno paralelo ao crânio. Corte de cada lado para os olhos. Corte entre os olhos com uma pequena tesoura para separar o crânio e o cérebro da cabeça.
Com duas pinças, agarre o crânio perto dos bulbos olfativos e rasgue cuidadosamente o crânio. Com uma lâmina de barbear, remova o cerebelo e o bulbo olfativo e corte o cérebro em dois pedaços. Coloque as peças cerebrais em uma placa de Petri contendo 40 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio.
Prepare a mistura de dissociação de acordo com esta tabela. Transfira 12 peças cerebrais para um tubo C para um peso total de 1,2 gramas por tubo de dissociação. Em seguida, coloque tubos C no dissociador com aquecimento.
Inicie o programa NTDK otimizado no dissociador. Centrífuga por 20 segundos. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes.
Transfira as células para quatro tubos de 15 mililitros com filtros acoplados. Lave os filtros com 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio. Centrifugar por 10 minutos e remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 mililitros.
Adicione cuidadosamente 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio e ressuspenda o pellet. Novamente, centrifugar e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet com seis mililitros de buffer de classificação.
Repita a centrifugação e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de microesferas CD11b e incube os tubos por 15 a 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a incubação, ressuspeite o pellet com seis mililitros de tampão de classificação.
Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet com oito mililitros de buffer de classificação. Em seguida, siga o programa Possel no separador para preparar oito colunas. Passe as células através da coluna adicionando um mililitro de suspensão celular de cada vez.
Com um mililitro de tampão de classificação, elimine células CD11b-positivas em uma placa de eluição estéril. Junte as células em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar e ressuspender o pellet com 10 mililitros de meio microglia fria.
Conte as células CD11b positivas. Ressuspeite as células em meio microglia frio para obter uma concentração final de 650.000 a 700.000 células por mililitro. Dispensar a suspensão em placas de cultura celular.
Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, substitua o meio por meio de micróglia pré-aquecido e repita a incubação durante a noite. Estimule as células antes desta etapa e realize o ensaio fagocítico durante as últimas três horas da estimulação.
Calcule o número de contas de acordo com esta tabela em uma proporção de 50 contas por célula. Prepare a mistura de contas. Incube o tubo por uma hora em banho-maria a 37 graus Celsius.
Vórtice a cada 10 minutos. A cada poço, adicione o volume calculado da solução de grânulos e incube por três horas. Usando essa abordagem, a atividade fagocítica da micróglia foi avaliada após a estimulação por fatores pró-inflamatórios, como interleucina-1 beta, mais interferon gama ou lipopolissacarídeos.
Após estimulação por seis a 24 horas, as esferas fluorescentes da micróglia Cy3 foram analisadas por microscópio confocal. Após seis horas, a micróglia começa a fagocitar as esferas Cy3 apenas sob a condição de interleucina-1 beta mais interferon gama. Após 24 horas, houve aumento da fluorescência Cy3 para ambos os tipos de estimulação, destacando-se o aumento da atividade fagocítica.
A pureza da cultura microglial foi elevada pela citometria de fluxo, que mostrou aumento da viabilidade celular após a triagem. Usando citometria de fluxo e marcadores de população de células RT-qPCR foram analisados antes e depois de classificar células CD11b-positivas de cérebros de camundongos no oitavo dia pós-natal. Essas análises distinguiram várias populações de células cerebrais, como CX3CR135 para microglia, O4 ou OLIG2 para oligodendrócitos, NeuN ou sinaptofisina, para neurônios, e ACSA-2, ou GFAP para astrócitos.
Após a triagem celular com o anticorpo CD11b, apenas a micróglia foi obtida. É importante pipetar muito suavemente ao adicionar a suspensão à coluna para evitar o entupimento e evitar a morte mecânica das células. Após este método, a proteômica transcriptômica, como o sangue ocidental, ou Luminex, e até mesmo a imunoquímica podem ser realizadas para ver o efeito da estimulação microglial.
