この作業は、ビクトリア州政府の運用インフラ支援とオーストラリア政府NHMRC IRIISSを通じて可能となり、国民保健医療研究評議会(ALW#1120300)とオーストラリア研究評議会(KJH#FT190100265)からの資金提供によって支援されました。著者らは、モナッシュ動物研究プラットフォーム、モナッシュ菌学プラットフォーム、モナッシュマイクロイメージング施設の技術サポートを認めたい。

卵巣は雌のC57BL6Jマウスから採取した。すべての動物の手順と実験は、動物のケアと使用のためのNHMRCオーストラリアの行動規範に従って行われ、モナッシュ動物研究プラットフォーム動物倫理委員会によって承認されました。
注:原始卵胞卵母細胞を枯渇させることが示された化学療法剤は、ステテロロジー11および直接カウント12、13を使用して決定されたように、同じ動物の2つの計数方法を比較するためにこの報告書で使用された。雌の8週齢(若年成人)マウスは、シクロホスファミド(n=5/群)の75mg/kg/体重の腹腔内注射の前に体重を量った。この用量は、原胞のおよそ50%の枯渇を引き起こすことが示されているが、マウス14において罹患率または死亡率を引き起こすことは報告されていない。卵巣は治療後48時間後に収穫された。各動物からの1つの卵巣は、24時間、24時間、もう一方はブインの溶液中に24時間、中性緩衝ホルマリン溶液に10%(v/v)で固定された。その後、組織をグリコールメタクリレート樹脂に包埋し、20μmで連続的に切断するか、またはパラフィンで5μmで連続的に切り離した。全ての組織を周期酸シフおよびヘマトキシリンで染色した。
1. 組織学的準備:マウス卵巣の固定、処理、埋め込み、切除
<ol><li>卵巣自体を損傷または切断することなく、卵管および周囲のすべての脂肪をトリミングすることによってマウス卵巣を解剖する。必要に応じて、このステップに解剖顕微鏡と細かい刃を使用します(図1A)。</li>
	<li>70%エタノールに組織を移す前に、24時間(図1B)のブイン固定(ステテロロジー)、またはホルマリン固定剤(直接カウント)のいずれかを含む小さなラベル付きチューブに入れることで、組織を直ちに固定化します。 注:卵胞形態は、ブアンの固定卵巣組織内で最もよく保存され、グリコールメタクリレート樹脂に埋め込まれています(図2)。</li>
	<li>全体の固定卵巣を処理し、ステテロ学のためのグリコールメタクリレート樹脂に埋め込む (補助ファイル 1), またはパラフィンワックス直接カウント用標準組織学的プロトコルを使用します。 注意:樹脂は有毒であるため、すべての組織処理手順がヒュームフードで実行され、手袋が常に着用されていることを確認してください。</li>
	<li>ガラスナイフ(図1D)を取り付けた特殊樹脂メタクリル酸ミクロトーム(図1C)を使用して、厚いグリコールメタクリレート樹脂切片(例えば、20μm)を徹底的に切断します。滅菌のためにガラス顕微鏡スライドに一定の間隔(例えば、3番目のセクションごと)でセクションを収集します。</li>
	<li>標準的なミクロトームを使用して、薄いパラフィンセクション(例えば、4〜6 μm)を切断してください。直接卵胞数のためにガラス顕微鏡スライドに一定の間隔(例えば、9番目 のセクションごと)で組織切片を収集します。</li>
	<li>周期酸シッフおよびヘマトキシリン(補足ファイル2)でスライドを染色する。</li>
	<li>パラフィン切片用の標準DPX、グリコールメタクリレート樹脂切片用の厚いDPXを含むカバースリップ(図1E)。 注意:グリコールメタクリル樹脂DPXは危険であるため、フームフードにこのステップを実行します。 注:グリコールメタクリレート樹脂DPXは非常に粘性です。ガラスカバースリップは、DPXが均等かつ薄く分散され、カバースリップの下に気泡がないことを確認するために、スパチュラで押し下げてしっかりと接着する必要があります(図1F)。</li>
</ol>2. 光学分光器を用いた原始卵数の立体的推定
<ol><li>コンピュータ、マルチコントロールユニット、カメラ、およびステローロジー内の光源をオンにし、顕微鏡の目的を低倍率(例えば、10倍)に設定します。</li>
	<li>ステオロジーソフトウェアを開きます。</li>
	<li>最初のスライドを顕微鏡のステージにしっかりと置きます。</li>
	<li>カメラ設定パネル (補足図 1A)の[露出]の下の[自動]をオンにして、光の露出を調整します。または、光の露出を手動で調整します。</li>
	<li>ジョイスティックを使用して最初の組織サンプルを見つけ、サンプルを焦点にします。</li>
	<li>[カメラ設定] パネルの右下にある[その他の設定]をクリックしてホワイトバランスを調整し、[ホワイトバランス] をクリックして [自動] をクリックします (補足図 1B)。または、[その他の設定]ボタン (または [その他の設定] の領域を選択) の横にある[ホワイト バランス] ボタンをクリックして、セクションの白い領域を選択してホワイト バランスを手動で設定します。</li>
	<li>[プローブ] ドロップダウン メニューに移動し、[光学分数のワークフロー] をクリックします。次に、[新しいプロジェクトの開始] をクリックし、[OK]をクリックします。
	<ol>
<li>既存のサンプリング構成が保存されている場合は、[ サンプリング パラメータ] で [ はい ] をクリック| .. をクリックし、目的のサンプリング構成を選択します。</li>
		<li>ない場合は、[ いいえ ]をクリックし、シリアルセクション情報(補足図1C)を手動で入力し、ステップ2.13でプローブ構成を定義します。</li>
	</ol></li>
	<li>[次へ]をクリックし、顕微鏡を低倍率に設定し、ドロップダウンメニューから10倍の倍率を選択します。</li>
	<li>[次へ] をクリックし、卵巣セクション全体をトレースします - セクションの周りを左クリックして開始し、最後に[輪郭を閉じる]を選択します。</li>
	<li>[次へ]をクリックし、顕微鏡を「高倍率」に設定し、ドロップダウンメニューから100倍のオイル倍率を選択します。</li>
	<li>スライド上の組織部に油を一滴置き、顕微鏡の目的を100倍の倍率に移動します。</li>
	<li>ライト露出を調整し(手順 2.4)、[ 次へ]をクリックします。</li>
	<li>サンプリング パラメータを設定して、プローブの構成を定義します。ここで、計数フレームを47.5 μm x 47.5 μm(2,256.25 μm2)に設定し、ステップ長を100 μm x 100 μm(10,000 μm2)に設定した(補足図2)。サンプリング パラメータが確立されたら、テンプレートを保存し、ステップ 2.7 で以降の分析セッション中に再度開きます。</li>
	<li>[カウント開始] をクリックします (補助図 1D)。サンプルの先頭にフォーカスし、[OK]をクリックしてカウントを開始します。</li>
	<li>焦点を合わせるノブを使用して、10 μmのサンプリング深度を移動し、卵母細胞核が焦点を合わせる原胞を数えます。[ 次へ ] をクリックして次の領域に移動します。<ol>
<li>卵母細胞が扁平上皮(平坦化)顆粒球細胞に囲まれている場合、卵胞を原始子として分類するが、立方腺細胞はない(図2A)。 注意:原始卵胞は、立方体および扁平上皮顆粒細胞(図2B)と主に立方体顆粒細胞に囲まれた原発卵胞の組み合わせからなる中間/移行卵胞とは異なる(図2C)。これらの卵胞クラスは別々に定量化する必要があります。</li>
		<li>卵母細胞の核が見える卵胞のみを数えます。卵母細胞核は、計数フレーム内に現れるか、または計数フレームの緑色の包含線に触れている必要があります(補助図1E、F)。</li>
		<li>卵母細胞核が計数フレーム(補助図1G)の外に落ちる場合、またはカウントフレームの赤い除外線に触れた場合は、この卵胞をカウントしないでください。</li>
		<li>外因性の化学物質(例えば、化学療法)に応答して原始卵胞の枯渇を評価する場合、数えられるすべての卵胞が健康であり、したがって正常な形態を有していることを確認する(図2)。異常な卵胞や食痛卵胞を別々に数えます。しばしば、卵胞死は化学療法などの侮辱によって誘発され、そして、健康な卵胞と不死菌の卵胞を区別するために、卵胞の定量は、卵巣予備軍15を含むだけであるように、別々に得られるべきである。</li>
	</ol></li>
	<li>そのセクションでカウントが完了したら、次のいずれかの操作を行います。<ol>
<li>[ 新しいセクションの追加] をクリックし、手順 2.3 に戻って次のセクションをカウントするように設定します。</li>
		<li>[ カウントが終了しました ] をクリックしてセッションを終了します。目的を10倍に戻し、ステロジーソフトウェアを終了し、光源、カメラ、マルチコントロールユニット、コンピュータをオフにします。</li>
	</ol></li>
	<li>卵巣全体からサンプリングした各組織セクションから生卵数(Q)の合計を求め、次にスプレッドシートを使用して、以下の式を用いて各複製動物(N)4から最終的な値を得る。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">どこ： N = 卵巣内の卵胞の総推定数。 Q = 原始毛の数。 f1 = サンプリング間隔。3番目のセクションはすべて、このようにサンプリングされました <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> 。 f2 = カウントフレーム (サンプル領域) とステッパーの関係を、 として計算 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> します。サンプル面積は2256μm2(47.5 μm x 47.5 μm)で、ステッパー面積は10000 μm2(100 μm x 100 μm) <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> であった。 f3 = サンプリングされた卵巣セクションの画分。20μmのセクションの10μmをサンプリングしたので、 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . したがって、 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> . 注:このプロトコルは、広く引用されたステロジーソフトウェア(資料文献)を使用して、これらの原理の立体分析を適用する方法を説明しています。ただし、他のステレオロジーソフトウェアも利用できます。卵巣卵胞の立体的分析中に適用される原理は、パラメータを設定するために使用されるソフトウェアに関係なく、同じです。ステレロジーは、10%以下の推定値の誤差係数を与えるため、100個以上の物体が成体マウス卵巣4に数えられると最も正確である。ここで概説するサンプリングパラメータは、約100個の物体(すなわち、原始、過渡期および原発性卵胞)を制御成人型C57BL6J卵巣で数えられるように最適化されている。試験的研究は、分析する区間およびセクション数、およびサンプリングされたセクション17内の光学崩壊セクタの数などの最適なサンプリングパラメータを確立するための小さなサンプルサイズを含めて実施することができる。</li>
</ol>3. 直接卵巣卵胞数による原始卵胞数の推定
<ol><li>顕微鏡スライドを標準的な軽顕微鏡の下にしっかりと置き、直接カウントを行い、生の原始卵胞数を得る。<ol>
<li>卵母細胞がはっきりと見え、扁平上皮(平坦化された)顆粒球細胞に囲まれている場合、卵胞を原始子として分類するが、立方体顆粒球細胞はない(図2D)。 注意:原始卵胞は、立方体および扁平上皮顆粒細胞(図2E)と主に立方体顆粒細胞に囲まれた原発卵胞の組み合わせからなる中間/移行卵胞とは異なる(図2F)。これらの卵胞クラスは別々に定量化する必要があります。</li>
		<li>カウントされたすべての卵胞が正常であり、したがって正常な形態を有することを確認する(図2)。健康な卵胞だけが卵巣予備軍を構成するので、異常な卵胞または食前包を別々に数える。</li>
	</ol>
</li>
	<li>あるいは、複数の、または、画像ファイルを開くことによってカウントを実行するために、卵巣組織セクション全体の高出力(例えば、20倍)のマイクロ顕微鏡写真を取る。これは手動で行うか、自動スライドスキャナーを使用して行うことができます。</li>
	<li>所定の間隔で卵巣全体からサンプリングした各組織部分から生卵数(Q)の合計を求める。この数値にサンプリング分数の逆数を掛けて、以下の式を使用して各複製動物(N)の最終値を求めます。 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">どこ： N = 卵巣内の卵胞の総推定数。 Q = 生の卵胞数(個々のタイプの、別々に計算)。 f1 = サンプリング間隔。9番目のセクションごとにサンプリングされた <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> . したがって、 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"> .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. 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著者らは開示するものは何もない。

この記事では、マウスの原始卵胞、ステテロロジー、および直接卵胞の数え方がより一般的に採用される方法を列挙するためのゴールドスタンダード技術のステップバイステッププロトコルを提供します。化学療法治療は、同じ動物から左右の卵巣内のこれら2つの異なる方法から得られた結果を比較対照するために使用した。どちらの方法も、原始卵胞数における高い動物間変動性を明らか...

卵巣の原始卵胞内に貯蔵された未熟で、機始的に逮捕された卵母細胞は、女性生殖細胞系列の貯蔵単位であり、個人の生涯卵巣予備軍を構成する。原胞の数は、1歳とともに自然に減少し、あるいはあるいは、空気中のいくつかの医薬品および環境毒性物質を含む外因性化学物質への暴露後に早期に枯渇する可能性がある2。原始卵胞数が有限であることを考えると、卵巣内に存在する卵胞の量と質は、主に女性の生殖能力と子孫の健康を決定する。したがって、女性における原始卵胞数の正確な定量化は、卵巣予備軍に対する外因性侮辱のオフターゲットの影響を評価するために不可欠である。
女性では、卵巣全体の分析は一般的に不可能であり、したがって卵巣予備の非侵襲的代理手段は臨床現場で利用されなければならない。抗Mϋllerianホルモン(AMH)は、臨床的に最も広く使用されている代理バイオマーカーです。血清AMHレベルは、多くの場合、進行した母親の年齢の女性、または化学療法などの癌治療の前後に測定されます。しかし、AMHは原始卵胞ではなく卵胞を成長させることによって産生され、したがって、血清レベルは絶対的な原始卵胞数では知らない。
げっ歯類などの小動物モデルの卵巣卵胞を数える その場の女性の原始卵胞数を正確に決定する方法がないため、外因性の侮辱が原始卵胞に与える程度を評価し、生殖能力を評価するために不可欠な研究ツールであり続ける。残念ながら、げっ歯類モデルにおける原始卵胞数の文献全体の報告は非常に可変的です 4.この主な理由は、採用されたカウント方法の技術的な違いが広く報告されている。主に、マウスの原胞を列挙するための文献に記載されている2つの異なる技術がある。これらには、分数光学解質法を採用するステレロジー、および直接卵胞数が含まれる。
ステレロジーは、体系的な均一なランダムサンプリング5を使用し、マウス全体で原始卵数を定量する最も正確な方法、またはラット卵巣4、6、7を使用するため、金本位制と広く考えられている。ステレロジーは、対象物8の立体構造を占めているため、公平である。光学脱離/分化法を用いて、3段階のサンプリングを適用して、マウス総卵巣の既知の分数内で厚い組織切片(例えば20μm)を使用して原胞を定量化する。まず、サンプリング間隔がランダムな開始(サンプリング分1、f1)4で選択されます(例えば、3番目のセクションごと)。その後、セクションは、この時点から卵巣全体を通して体系的で均一な方法でサンプリングされる。次に、バイアスされない計数フレームが卵巣セクションの上に重ね合わされ、定義されたランダム化されたカウントグリッド(サンプリング分数2、f2)8に沿って徐々に移動する。最後に、断面厚さの既知の分率は光学的にサンプリングされ(例えば、10μm)、この領域内の卵胞は計数される(サンプリング分画3、f3)4。生の卵胞数は、最終的な値を得るために、これらのサンプリング分数の逆数で乗算されます。この方法では、ステレオロジーソフトウェアによって駆動される電動ステージを備えた顕微鏡を含む専門家の訓練と機器が必要です。組織は特殊なブインの固定液に保存し、グリコールメタクリレート樹脂に埋め込まれ、ガラスナイフを用いたグリコールメタクリレート樹脂ミクロトームを使用して厚い組織切片を切断できるようにする必要があります。この方法は、組織の収縮および変形を考慮して設計されており、卵巣および卵胞9の三次元形態構造を最もよく保存する。
直接卵胞カウントは、卵胞10を数える最も頻繁に使用される方法です。より一般的な固定剤(すなわち、ホルマリン)を使用することができ、その後に4〜6μmの厚さの標準ミクロトームを使用してパラフィンワックス埋め込みおよび網羅的なシリアル切除が行われる。卵胞は、定義された間隔で組織セクション全体で体系的にカウントされ、次にサンプリング間隔の逆数を掛けて全卵胞の推定値を得る。この方法は、迅速かつ容易に、アーカイブされた組織を使用して行うことができる、および標準的な組織学的手法を使用して調製される。それは標準的なイメージ投射機能の軽い顕微鏡だけ要求する。しかし、これらの利点にもかかわらず、直接卵胞カウントはステレロジーの精度と厳格なカウントパラメータを欠いているため、研究者の偏見が強くなります。さらに、組織は処理中に収縮および変形を受け、卵巣の完全性および形態を破壊し、卵胞の分類および定量化を困難にする。
この記事の目的は、マウス卵巣の原始卵胞数を定量的に評価するために一般的に使用される2つの方法を説明することです: 生殖器と直接卵胞の数え。我々は、これらの2つの方法の詳細なプロトコルを提供し、我々の分野で再現性を高め、研究者が彼らの研究のための最も適切なカウント方法の情報に基づいた決定を行うことを可能にするために、それらの長所と短所のいくつかを強調する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

性的に再生する女性の哺乳類は、卵母細胞の生涯供給で生まれます。未熟な静止卵母細胞は、原始卵胞、女性生殖細胞の貯蔵単位内で発見される。彼らは再生不可能であるため、出生時の数とその後の損失率は、主に女性の肥沃な寿命を決定します。女性および動物における原始卵数の正確な定量は、卵巣予備軍に対する医薬品および毒性物質の影響を決定するために不可欠である。また、既存および新興の不妊治療保存技術の必要性と成功を評価する必要があります。現在、女性における卵巣予備を含む原胞の数を正確に測定する方法は存在しない。さらに、実験のために大型動物や絶滅危惧種から卵巣組織を得ることは、しばしば実現不可能である。このように、マウスはこのような研究に不可欠なモデルとなっており、マウスの卵巣全体で原胞数を評価する能力は重要なツールです。しかし、文献中のマウス卵巣の絶対卵胞数の報告は非常に変動するため、データの比較や複製が困難です。これは、株、年齢、治療群、および採用されたカウント方法の技術的な違いを含む多くの要因によるものです。本稿では、分数/光学解離技術に依存する[1]ステレロジーという2つの異なる方法を用いて、組織学的セクションを準備し、マウス卵巣の原始卵胞を数えるステップバイステップの指導ガイドを提供します。そして[2]直接カウント技術。各方法の主な利点と欠点のいくつかは、現場で再現性を向上させ、研究者が研究に最も適した方法を選択できるように強調されます。

卵胞枯渇の特徴のあるモデルが使用され、若年成人雌マウスにシクロホスファミド化学療法の単回投与、または生理的車両制御(n=5/群)を投与し、両方の卵巣を48時間後に各動物から採取した。動物ごとに1つの卵巣を、ステテロロジーまたは直接カウントの2つの方法のそれぞれについてステップ1で説明したように調製した。各動物からの左右の卵巣を各群にランダムに割り当てた。これらの?...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

ここでは、固定マウス卵巣組織の正確な卵胞数を計算するための2つの異なる技術について説明し、比較し、対比する。

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K ビュー.  Monash University. ここでは、固定マウス卵巣組織の正確な卵胞数を計算するための2つの異なる技術について説明し、比較し、対比する。

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

発生生物学

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

牛の初期のアンタル卵胞からの卵母細胞のための体外培養戦略

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

羊の成人および前頭前卵巣から採取された体外期の成熟卵母細胞のガラス化

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...