Ici, nous démontrons notre protocole d’isolement des cellules sinusoïdales hépatiques primaires de souris ou d’isolement des CSLS. Le protocole consiste en une perfusion de collagénase hépatique et une ultracentrifugation à basse vitesse pour la purification des cellules non parenchymateuses et la sélection de billes magnétiques CD146. Notre méthode d’isolement LSEC est très efficace et applicable au foie de souris sain et malade.
Les LSTEC isolés affichent une grande pureté et préservent la structure et la fonction. Les CSL isolés à l’aide de ce protocole sont optimaux pour les études fonctionnelles et moléculaires et la génération de données multi-omiques. Ce protocole sera utile pour étudier la communication intercellulaire dans le foie.
Commencez par recouvrir les plats de culture de 10 centimètres de trois millilitres de solution de collagène. Ensuite, incubez les plats à température ambiante pendant une heure. Après une heure, retirez l’excès de liquide de la surface revêtue.
Lavez la vaisselle avec du PBS trois fois et laissez-les sécher à l’air. Installez l’appareil de perfusion à recirculation chauffé et humidifié. Rincez le système de perfusion à l’aide de 10% d’eau de Javel pendant cinq minutes.
Ensuite, rincez à nouveau le système avec de l’eau stérile pendant encore 10 minutes. Égouttez le liquide de rinçage autant que possible avant de le perfuser avec une solution de collagénase. Infuser la solution de collagénase à travers le système de perfusion pour la préchauffer à 37 degrés Celsius.
Réglez le taux de la pompe sur une vitesse sur le cadran de contrôle de vitesse. Gardez la même vitesse tout au long de la procédure. Pesez la souris pour la procédure.
Ensuite, fixez-le à la surface chirurgicale. Vaporiser l’abdomen de la souris avec 70% d’éthanol. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision d’environ cinq centimètres à partir de la partie inférieure de l’abdomen jusqu’au processus xiphoïde.
Après cela, faites deux coupes latérales à l’aide de petits ciseaux à iris de chaque côté de l’abdomen pour exposer complètement les organes abdominaux. Placez la gaine du cathéter IV sous le dos de l’animal pour soulever et niveler l’abdomen. À l’aide d’une pince de pansement incurvée régulière, retirez doucement les intestins et l’estomac vers la gauche de l’animal.
Ensuite, placez une suture chirurgicale 5-0 sous la veine cave inférieure, ou IVC, juste en dessous du rein gauche exposé. Attachez un attelage lâche dans la suture. Ensuite, placez une autre suture chirurgicale 5-0 autour de la veine porte hépatique.
Placez la suture juste au-dessus du point de ramification de la veine splénique de la veine porte hépatique. Encore une fois, attachez un attelage lâche dans la suture. En utilisant la suture de la veine porte comme tension, insérez le cathéter IV de calibre 20 dans la veine porte hépatique un centimètre plus bas où elle se ramifie vers la veine porte hépatique droite et gauche.
Ensuite, faites glisser le cathéter vers le haut de la veine, mais gardez-le sous la zone de ramification. Laissez le sang circuler le long du cathéter jusqu’à ce qu’il commence à s’égoutter. Fixez le cathéter IV avec la suture de la veine porte.
Utilisez une ligne IV pour fixer un flacon IV avec tampon A au cathéter. Ensuite, rincez le foie avec cette solution tout en évitant l’entrée d’air dans le système. Attachez la suture autour de la CIV sous le rein.
Après cela, coupez la CIV sous la suture pour permettre à l’animal de saigner. Une fois perfusé, coupez l’estomac, les intestins, la rate et les autres entrailles attachées au foie. Ensuite, coupez le diaphragme et les principaux vaisseaux de la cavité thoracique.
Retirez le foie de l’animal et placez-le sur le plateau de perfusion. Retirez soigneusement la ligne IV et branchez la solution de collagénase dans la chambre de recirculation. Laissez le foie perfuser jusqu’à ce que la capsule soit modelée et paraisse pâteuse.
Cela devrait généralement prendre de 10 à 15 minutes. Une fois digéré, retirez le foie de la chambre et placez-le sur une boîte de Petri de 10 centimètres avec environ 20 millilitres de DMEM sans sérum. Séparez délicatement le foie avec quelques pointes de pipette et jetez l’arbre biliaire.
Après cela, filtrez la suspension hépatique à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger la suspension de la cellule à 50 fois G pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, collectez le surnageant contenant des cellules hépatiques non parenchymateuses.
Centrifugez le surnageant à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après cela, collectez la pastille de cellule et remettez-la en suspension dans un millilitre de tampon d’isolement. Déterminez le numéro de cellule à l’aide d’un compteur de cellules automatique en suivant les instructions du fabricant.
Ensuite, centrifugez la suspension de la cellule. Aspirer entièrement le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 90 microlitres de tampon d’isolement pour 10 millions de cellules. Ajoutez 10 microlitres de microbilles CD146 pour 10 millions de cellules au total.
Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Pour laver les cellules, ajoutez un à deux millilitres de tampon d’isolement pour 10 millions de cellules. Centrifuger la solution à 300 fois G pendant 10 minutes.
Après cela, aspirez entièrement le surnageant et remettez en suspension jusqu’à un milliard de cellules dans 500 microlitres de tampon d’isolement. Ensuite, préparez la colonne de séparation en la rinçant avec trois millilitres de tampon d’isolement. Appliquez la suspension de la cellule sur la colonne empilée avec des filtres de pré-séparation de 70 micromètres.
Lavez la colonne avec trois millilitres de tampon d’isolation trois fois. Après cela, retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Pipette cinq millilitres de tampon d’isolation sur la colonne.
Pour récupérer les cellules marquées par des billes magnétiques, poussez fermement le piston dans la colonne pour débusquer les cellules. Enfin, centrifugez les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. La pureté et les marqueurs de surface isolés des CSL ont été évalués par cytométrie en flux.
L’analyse des données et la stratégie de contrôle pour les LSEC et les singlets fermés sont basées sur des données de dispersion vers l’avant et de dispersion latérale. Les CSLS isolés ont été colorés avec un colorant de viabilité et une combinaison d’anticorps CD45, CD146 et Stabilin-2. Les CSL viables ont été fermés sur la population DE CD45 négatif et analysés pour l’expression de CD146 et de Stabilin-2.
À partir de ces données, il a été confirmé que les CSL isolés avaient une viabilité supérieure à 94 % et une pureté supérieure à 90 %. Le phénotype spécifique au LSEC des cellules isolées a été confirmé par microscopie optique et microscopie électronique à balayage. Les CSLS isolés ont été cultivés dans le milieu de croissance complet pendant six heures et examinés par microscopie optique.
Les flèches blanches dans l’image SEM indiquent LSEC fenestrae, qui est une caractéristique morphologique caractéristique des LSTEC. Les étapes critiques pour assurer la perfusion complète d’un tissu hépatique sont le positionnement approprié du ruban de cathéter, en évitant l’introduction d’air dans le cathéter et le moment optimal de la digestion de la collagénase. Le LSEC de haute qualité acquis à l’aide de notre protocole facilitera l’identification du mécanisme moléculaire de la fonction LSEC et améliorera notre compréhension de leur rôle dans la communication intercellulaire dans le foie, dans la santé et dans la maladie.
