Burada, primer fare karaciğeri sinüzoidal hücre izolasyonu veya LSECs izolasyonu protokolümüzü gösteriyoruz. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu ve parankimal olmayan hücre saflaştırması ve CD146 manyetik boncuk seçimi için düşük hızlı ultrasantrifüjlemeden oluşur. LSEC izolasyon yöntemimiz oldukça verimlidir ve sağlıklı ve hastalıklı fare karaciğerine uygulanabilir.
İzole edilmiş LSEC'ler yüksek saflık gösterir ve yapıyı ve işlevi korur. Bu protokol kullanılarak izole edilen LSEC'ler, fonksiyonel ve moleküler çalışmalar ve multi-omik veri üretimi için optimumdur. Bu protokol, karaciğerdeki hücreler arası iletişimi incelemek için yararlı olacaktır.
10 santimetrelik kültür tabaklarını üç mililitre kollajen çözeltisi ile kaplayarak başlayın. Ardından, bulaşıkları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, fazla sıvıyı kaplanmış yüzeyden çıkarın.
Bulaşıkları PBS ile üç kez yıkayın ve havayla kurumasını bekleyin. Isıtmalı ve nemlendirilmiş devridaim perfüzyon aparatını kurun. Perfüzyon sistemini beş dakika boyunca% 10 ağartıcı kullanarak durulayın.
Ardından, sistemi 10 dakika daha steril suyla tekrar durulayın. Kollajenaz çözeltisi ile perfüze etmeden önce durulama sıvısını mümkün olduğunca boşaltın. Kollajenaz çözeltisini perfüzyon sisteminden geçirerek 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.
Pompa hızını, hız kontrol kadranındaki bir hızı olacak şekilde ayarlayın. Tüm prosedür boyunca hızı aynı tutun. İşlem için fareyi tartın.
Daha sonra cerrahi yüzeye sabitleyin. Fare karnına% 70 etanol püskürtün. Cerrahi makas kullanarak, karnın alt kısmından başlayarak ksifoid sürece kadar yaklaşık beş santimetrelik bir kesi yapın.
Bundan sonra, karın organlarını tamamen ortaya çıkarmak için karnın her iki tarafında küçük iris makası kullanarak iki yanal kesim yapın. Karnı kaldırmak ve düzleştirmek için IV kateterin kılıfını hayvanın sırtının altına yerleştirin. Düzenli bir kavisli pansuman forseps kullanarak, bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru yavaşça çekin.
Daha sonra, maruz kalan sol böbreğin hemen altındaki inferior vena kava veya IVC'nin altına 5-0'lık bir cerrahi sütür yerleştirin. Dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın. Daha sonra, hepatik portal venin etrafına 5-0 cerrahi sütür daha yerleştirin.
Sütürü, hepatik portal venin dalak damar dallanma noktasının hemen üzerine yerleştirin. Yine, dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın. Portal ven sütürünü gerginlik olarak kullanarak, 20-gauge IV kateteri, sağ ve sol hepatik portal vene dallandığı bir santimetre aşağıda hepatik portal ven içine yerleştirin.
Ardından, kateteri damardan yukarı kaydırın, ancak dallanma alanının altında tutun. Kanın damlamaya başlayana kadar kateterden aşağı inmesine izin verin. IV kateteri portal ven sütürü ile sabitleyin.
Kateterine A tamponlu bir IV şişesi takmak için bir IV hattı kullanın. Daha sonra, sisteme hava girmesini önlerken karaciğeri bu çözelti ile yıkayın. Böbreğin altındaki IVC'nin etrafındaki dikişi bağlayın.
Bundan sonra, hayvanın kanamasına izin vermek için IVC'yi dikişin altında kesin. Rahatsız ettikten sonra, mideyi, bağırsakları, dalağı ve karaciğere bağlı diğer bağırsakları kesin. Ardından, diyaframı ve ana damarları göğüs boşluğundan kesin.
Karaciğeri hayvandan çıkarın ve perfüzyon tepsisine yerleştirin. IV hattını dikkatlice çıkarın ve kollajenaz çözeltisini devridaim odasına bağlayın. Kapsül modellenene ve yumuşak görünene kadar karaciğerin perfüzyonuna izin verin.
Bu işlem genellikle 10 ila 15 dakika sürecektir. Sindirildikten sonra, karaciğeri odadan çıkarın ve yaklaşık 20 mililitre serumsuz DMEM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Karaciğeri birkaç pipet ucuyla yavaşça ayırın ve safra ağacını atın.
Bundan sonra, karaciğer süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında iki dakika boyunca 50 kez G'de santrifüj yapın. Daha sonra, parankimal olmayan hepatik hücreler içeren süpernatantı toplayın.
Süpernatantı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. Bundan sonra, hücre peletini toplayın ve bir mililitre izolasyon tamponunda yeniden askıya alın. Üreticinin yönergelerini izleyerek otomatik hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin.
Ardından, hücre süspansiyonunu santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin ve peleti 10 milyon hücre başına 90 mikrolitre izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın. Toplam 10 milyon hücre başına 10 mikrolitre CD146 MicroBeads ekleyin.
İyice karıştırın ve dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri yıkamak için, 10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre izolasyon tamponu ekleyin. Çözeltiyi 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin.
Bundan sonra, süpernatantı tamamen aspire edin ve 500 mikrolitre izolasyon tamponunda bir milyara kadar hücreyi yeniden askıya alın. Daha sonra, ayırma kolonunu üç mililitre izolasyon tamponu ile durulayarak hazırlayın. Hücre süspansiyonunu, 70 mikrometrelik ön ayırma filtreleriyle istiflenmiş sütuna uygulayın.
Kolonu üç mililitre izolasyon tamponu ile üç kez yıkayın. Bundan sonra, kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Pipet, kolon üzerine beş mililitre izolasyon tamponu yerleştirin.
Manyetik boncuk etiketli hücreleri kurtarmak için, hücreleri temizlemek için pistonu sütuna sıkıca itin. Son olarak, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. İzole LSEC'lerin saflığı ve yüzey belirteçleri akım sitometrisi ile değerlendirildi.
Kapılı LSEC'ler ve tekiller için veri analizi ve geçit stratejisi, ileri dağılım ve yan saçılma verilerine dayanmaktadır. İzole LSEC'ler bir canlılık boyası ve CD45, CD146 ve Stabilin-2 antikorlarının bir kombinasyonu ile boyandı. Canlı LSEC'ler CD45 negatif populasyona bağlandı ve CD146 ve Stabilin-2 ekspresyonu için analiz edildi.
Bu verilerden, izole edilmiş LSEC'lerin% 94'ten daha fazla canlılığa ve% 90'dan fazla saflığa sahip olduğu doğrulandı. İzole hücrelerin LSEC'e özgü fenotipi, ışık mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak daha da doğrulandı. İzole LSEC'ler altı saat boyunca tam büyüme ortamında kültürlendi ve ışık mikroskobu ile incelendi.
SEM görüntüsündeki beyaz oklar, LSEC'lerin karakteristik bir morfolojik özelliği olan LSEC fenestrae'yi gösterir. Bir karaciğer dokusunun tam perfüzyonunu sağlamak için kritik adımlar, uygun kateter bandı konumlandırması, kateterde hava girmesini önlemek ve kollajenaz sindiriminin optimum zamanlamasıdır. Protokolümüz kullanılarak elde edilen yüksek kaliteli LSEC, LSEC fonksiyonunun moleküler mekanizmasının tanımlanmasını kolaylaştıracak ve karaciğerde, sağlıkta ve hastalıkta hücreler arası iletişimdeki rollerini anlamamızı geliştirecektir.
