Aqui, demonstramos nosso protocolo de isolamento primário de células sinusoidais do fígado do rato ou isolamento de LSECs. O protocolo consiste em perfusão de colagem hepática e ultracentrifugação de baixa velocidade para purificação celular não parenchymal e seleção de contas magnéticas CD146. Nosso método de isolamento LSEC é altamente eficiente e aplicável ao fígado de camundongo saudável e doente.
Os LSECs isolados apresentam alta pureza e preservam a estrutura e a função. Os LSECs isolados usando este protocolo são ótimos para estudos funcionais e moleculares e geração de dados multi-omics. Este protocolo será útil para estudar a comunicação intercelular no fígado.
Comece por revestir pratos de cultura de 10 centímetros com três mililitros de solução de colágeno. Em seguida, incubar os pratos em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, remova o excesso de fluido da superfície revestida.
Lave os pratos com PBS três vezes e deixe-os secar. Configure o aparelho de perfusão aquecido e umidificado. Enxágüe o sistema de perfusão usando 10% de alvejante por cinco minutos.
Em seguida, enxágue o sistema novamente com água estéril por mais 10 minutos. Escorra o líquido de lavagem o máximo possível antes de perfumar com a solução de colagemnase. Infundir a solução de colagem através do sistema de perfusão para pré-aniá-la a 37 graus Celsius.
Defina a taxa de bomba para acelerar uma no mostrador de controle de velocidade. Mantenha a velocidade igual durante todo o procedimento. Pesar o rato para o procedimento.
Em seguida, fixá-lo na superfície cirúrgica. Pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de aproximadamente cinco centímetros, desde a parte inferior do abdômen até o processo xifoide.
Depois disso, faça dois cortes laterais usando uma pequena tesoura de íris em cada lado do abdômen para expor totalmente os órgãos abdominais. Coloque a baia do cateter IV sob as costas do animal para levantar e nivelar o abdômen. Usando um fórceps curvos regulares, puxe suavemente os intestinos e o estômago para a esquerda do animal.
Em seguida, coloque uma sutura cirúrgica 5-0 sob a veia cava inferior, ou IVC, logo abaixo do rim esquerdo exposto. Amarre um engate solto na sutura. Em seguida, coloque outra sutura cirúrgica 5-0 ao redor da veia do portal hepático.
Coloque a sutura logo acima do ponto de ramificação da veia esplênica da veia hepática. Mais uma vez, amarre um engate solto na sutura. Utilizando a sutura venosa do portal como tensão, insira o cateter IV de calibre 20 na veia do portal hepático um centímetro abaixo de onde se ramifica para a veia do portal hepático direito e esquerdo.
Em seguida, deslize o cateter até a veia, mas mantenha-o abaixo da área de ramificação. Deixe o sangue viajar pelo cateter até que comece a escorrer. Fixar o cateter IV com a sutura venosa do portal.
Use uma linha IV para fixar uma garrafa IV com tampão A ao cateter. Em seguida, lave o fígado com esta solução, evitando a entrada de ar no sistema. Amarre a sutura ao redor do IVC abaixo do rim.
Depois disso, corte o IVC abaixo da sutura para permitir que o animal sangre. Uma vez perfumado, corte o estômago, intestinos, baço e outras entranhas presas ao fígado. Em seguida, corte o diafragma e os principais vasos da cavidade torácica.
Retire o fígado do animal e coloque-o na bandeja de perfusão. Remova cuidadosamente a linha IV e conecte a solução de colagem na câmara de recirculação. Deixe o fígado perfundir até que a cápsula fique modelada e pareça mole.
Isso normalmente deve levar de 10 a 15 minutos. Uma vez digerido, remova o fígado da câmara e coloque-o em uma placa de Petri de 10 centímetros com cerca de 20 mililitros de DMEM sem soro. Desmonte suavemente o fígado com algumas pontas de pipeta e descarte a árvore biliar.
Depois disso, filtre a suspensão hepática através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão da célula a 50 vezes G por dois minutos em temperatura ambiente. Em seguida, colete o supernatante contendo células hepáticas não parenchímicas.
Centrifugar o supernante a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois disso, colete a pelota celular e resuspense-a em um mililitro de tampão de isolamento. Determine o número da célula usando um contador automático de células seguindo as instruções do fabricante.
Em seguida, centrifugar a suspensão celular. Aspire o supernascer inteiramente e resuspenja a pelota com 90 microliters de tampão de isolamento por 10 milhões de células. Adicione 10 microliters de MicroEsferas CD146 por 10 milhões de células totais.
Misture bem e incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius. Para lavar as células, adicione um a dois mililitros de tampão de isolamento por 10 milhões de células. Centrifugar a solução a 300 vezes G por 10 minutos.
Depois disso, aspire o supernaente inteiramente e resuspenja até um bilhão de células em 500 microliters de tampão de isolamento. Em seguida, prepare a coluna de separação enxaguando-a com três mililitros de tampão de isolamento. Aplique a suspensão da célula na coluna empilhada com filtros de pré-separação de 70 micrômetros.
Lave a coluna com três mililitros de tampão de isolamento três vezes. Depois disso, remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo centrífuga de 15 mililitros. Pipeta cinco mililitros de tampão de isolamento na coluna.
Para recuperar as células magnéticas rotuladas por contas, empurre firmemente o êmbolo para dentro da coluna para esvaziar as células. Finalmente, centrifugar as células a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. A pureza isolada dos LSECs e os marcadores superficiais foram avaliados com citometria de fluxo.
A análise de dados e a estratégia de gating para LSECs e singlets fechados são baseados em dados de dispersão e dispersão lateral. LSECs isolados foram manchados com um corante de viabilidade e uma combinação de anticorpos CD45, CD146 e Stabilin-2. LSECs viáveis foram fechados na população negativa CD45 e analisados para a expressão CD146 e Stabilin-2.
A partir desse dado, foi confirmado que as LSECs isoladas apresentaram maiores 94% de viabilidade e maiores que 90% de pureza. O fenótipo específico do LSEC das células isoladas foi confirmado ainda usando microscopia leve e microscopia eletrônica de varredura. Os LSECs isolados foram cultivados no meio de crescimento completo por seis horas e examinados por microscopia leve.
As setas brancas na imagem SEM indicam fenestrae LSEC, que é uma característica morfológica dos LSECs. As etapas críticas para garantir a perfusão completa de um tecido hepático são o posicionamento adequado da fita do cateter, evitando a introdução de ar no cateter e o tempo ideal de digestão da colagemnase. LSEC de alta qualidade adquirida usando nosso protocolo facilitará a identificação do mecanismo molecular da função LSEC e melhorará nossa compreensão de seu papel na comunicação intercelular no fígado, na saúde e na doença.
