Здесь мы демонстрируем наш протокол первичной изоляции синусоидальных клеток печени мыши или изоляции LSECs. Протокол состоит из перфузии коллагеназы печени и низкоскоростного ультрацентрифугирования для непаренхиматозной очистки клеток и отбора магнитных шариков CD146. Наш метод изоляции LSEC очень эффективен и применим к здоровой и больной печени мыши.
Изолированные ЛСЭК обладают высокой чистотой и сохраняют структуру и функции. ЛСЭС, выделенные с использованием этого протокола, являются оптимальными для функциональных и молекулярных исследований и генерации мультиомных данных. Этот протокол будет полезен для изучения межклеточной связи в печени.
Начните с покрытия 10-сантиметровой культуральной посуды тремя миллилитрами раствора коллагена. Затем высиживать посуду при комнатной температуре в течение одного часа. Через час удалите лишнюю жидкость с покрытой поверхности.
Трижды вымойте посуду с PBS и дайте ей высохнуть на воздухе. Установите нагреваемый и увлажненный рециркуляционный перфузионный аппарат. Промойте перфузионную систему с использованием 10% отбеливателя в течение пяти минут.
Затем снова промойте систему стерильной водой еще на 10 минут. Процедите промывочную жидкость как можно больше перед перфузией раствором коллагеназы. Настаивают раствор коллагеназы через перфузионную систему, чтобы предварительно прогреть его до 37 градусов цельсия.
Установите скорость насоса на один на циферблате управления скоростью. Держите скорость одинаковой на протяжении всей процедуры. Взвесьте мышь для процедуры.
Затем закрепите его на хирургической поверхности. Опрыскивайте брюшко мыши 70% этанолом. С помощью хирургических ножниц сделайте разрез примерно в пять сантиметров, начиная от нижней части живота до мечевидного отростка.
После этого сделайте два боковых разреза, используя небольшие ножницы радужной оболочки с каждой стороны живота, чтобы полностью обнажить органы брюшной полости. Поместите оболочку IV катетера под спину животного, чтобы поднять и выровнять живот. Используя обычную изогнутую повязку щипцами, аккуратно оттяните кишечник и желудок влево от животного.
Затем поместите хирургический шов 5-0 под нижнюю полую вену, или IVC, чуть ниже открытой левой почки. Завяжите свободную сцепку в шов. Далее накладывают еще 5-0 хирургических швов вокруг печеночной воротной вены.
Поместите шов чуть выше точки ветвления селезеночной вены печеночной воротной вены. Опять же, завяжите свободную сцепку в шов. Используя швы воротной вены в качестве натяжения, вставьте катетер IV 20-го калибра в печеночную воротную вену на один сантиметр ниже, где он разветвляется на правую и левую печеночную воротную вену.
Затем сдвиньте катетер вверх по вене, но держите его ниже области ветвления. Позвольте крови пройти вниз по катетеру, пока она не начнет капать. Закрепите внутривенный катетер швом воротной вены.
Используйте внутривенную линию, чтобы прикрепить к катетеру флакон iv с буфером А. Затем промыть печень этим раствором, избегая попадания воздуха в систему. Завяжите шов вокруг IVC ниже почки.
После этого отрежьте IVC ниже шва, чтобы животное кровоточило. После перфузии отрежьте желудок, кишечник, селезенку и другие внутренности, прикрепленные к печени. Затем отрежьте диафрагму и основные сосуды от грудной полости.
Извлеките печень у животного и поместите ее на перфузионный лоток. Осторожно удалите внутривенную линию и подключите раствор коллагеназы в рециркуляционную камеру. Позвольте печени перфузиться до тех пор, пока капсула не станет смоделированной и не станет кашицеобразной.
Обычно это занимает от 10 до 15 минут. После переваривания извлеките печень из камеры и поместите ее на 10-сантиметровую чашку Петри с примерно 20 миллилитрами dmem без сыворотки. Аккуратно разберите печень парой кончиков пипетки и выбросьте билиарное дерево.
После этого фильтруют суспензию печени через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию в 50 раз G в течение двух минут при комнатной температуре. Затем соберите супернатант, содержащий непаренхиматозные печеночные клетки.
Центрифугируйте супернатант в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После этого соберите гранулу клетки и повторно суспендируйте ее в один миллилитр изоляционного буфера. Определите номер ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек, следуя инструкциям производителя.
Далее центрифугируют клеточную суспензию. Аспирировать супернатант полностью и повторно суспендировать гранулу с 90 микролитрами изоляционного буфера на 10 миллионов клеток. Добавьте 10 микролитров CD146 MicroBeads на 10 миллионов клеток.
Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы промыть клетки, добавьте один-два миллилитра изоляционного буфера на 10 миллионов клеток. Центрифугируйте раствор в 300 раз G в течение 10 минут.
После этого аспирируют супернатант целиком и повторно суспендируют до одного миллиарда клеток в 500 микролитрах изоляционного буфера. Далее подготовьте разделительную колонну, промыв ее тремя миллилитрами изоляционного буфера. Нанесите суспензию ячейки на колонну, уложенную 70-микрометровыми фильтрами предварительного разделения.
Трижды промыть колонну тремя миллилитрами изоляционного буфера. После этого снимите колонну с сепаратора и поместите ее на 15-миллилитровую центрифужную трубку. Пипетка пять миллилитров изоляционного буфера на колонну.
Чтобы восстановить ячейки, помеченные магнитным шариком, плотно втолкните поршень в колонну, чтобы промыть ячейки. Наконец, центрифугируйте клетки в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Изолированную чистоту ЛСЭС и поверхностные маркеры оценивали с помощью проточной цитометрии.
Анализ данных и стратегия сбора данных для закрытых ЛСЭК и синглетов основаны на данных прямого рассеяния и бокового рассеяния. Изолированные ЛСЭС были окрашены красителем жизнеспособности и комбинацией антител CD45, CD146 и Stabilin-2. Жизнеспособные LSECs были обнаружены на CD45 отрицательной популяции и проанализированы на cd146 и экспрессию стабилина-2.
Из этих данных было подтверждено, что изолированные ЛСЭК имели более 94% жизнеспособности и более 90% чистоты. LSEC-специфический фенотип изолированных клеток был дополнительно подтвержден с помощью световой микроскопии и сканирующей электронной микроскопии. Изолированные ЛСЭС культивировали в полной питательной среде в течение шести часов и исследовали с помощью световой микроскопии.
Белые стрелки на изображении SEM указывают на LSEC fenestrae, что является характерной морфологической особенностью LSECs. Критическими шагами для обеспечения полной перфузии ткани печени являются правильное позиционирование катетерной ленты, избегание введения воздуха в катетер и оптимальные сроки переваривания коллагеназы. Высококачественные LSEC, полученные с использованием нашего протокола, облегчат идентификацию молекулярного механизма функции LSEC и улучшат наше понимание их роли в межклеточной связи в печени, в здоровье и в болезни.
