ウイルス的に送達された光遺伝学的構築物は、急性脳スライスにおける特定のシナプスの生理学および可塑性の詳細な電気生理学的特性評価を可能にする。シナプスを光遺伝学的に活性化する主な利点は、長距離経路を研究する能力と、解剖学的に分離されていない軸索の選択的刺激です。手順を実演するのは、私たちの研究室の研究員であるリサ・キナバネ博士です。
まず、ハミルトンシリンジを、定位固定装置フレームに取り付けられた可動アームに取り付けられたマイクロインジェクションシリンジポンプにロードします。次に、5マイクロリットルのウイルスアリコートをマイクロ遠心分離機に入れます。チューブを数秒間回転させ、2マイクロリットルのウイルス製剤をチューブの蓋にピペットで入れます。
シリンジにウイルス製剤を充填するには、手術用顕微鏡で針先を表示します。次に、ウイルスのボーラスを針の先端に手動で配置し、ポンプコントロールを使用してシリンジプランジャーを引き出します。ポンプの噴射量を300ナノリットル、流量を毎分100ナノリットルに設定します。
ポンプを作動させ、針先のウイルスの飛沫を観察して適切な流れを確認します。綿棒でウイルスを吸収し、70%エタノールで針をきれいにします。次に、脳定位固定装置フレームのアジャスターネジを使用して、針先をブレグマに移動し、フレームの3つのバーニアスケールで観察された定位固定装置測定値をメモします。
これらの距離をブレグマ座標から加算または減算します。脳定位固定装置アームに取り付けられたマイクロドリルを使用して、頭蓋骨表面にバリ穴を開けます。所定の背腹座標で脳に針を挿入し、所定量のウイルス製剤を注入する。
注入後、ボーラスの拡散を可能にするために針をその場で10分間放置します。.次に、針を取り外し、ポンプを作動させて、針が詰まっていないことを確認します。ウイルス注射の2週間後、ラットを安楽死させ、脳全体を急速に解剖し、それをスクロース切断溶液に移す。
金属製のティースプーンを使用して、脳を拾い上げ、余分な溶液を捨てて、ろ紙の上に置きます。メスを使用して小脳を取り除き、冠状平面の大脳をその長さのほぼ半分まで切断します。後半分はLEC組織ブロックです。
組織ブロックと残りの脳をスクロース切断溶液に戻します。次に、シアノアクリレート接着剤を一滴ビブラトームステージに置き、それを薄層に広げます。次に、小さじ1杯を使用して、LECティッシュブロックを選び、前冠状カットが付着するように接着剤パッチに移します。
ステージをビブラトーム組織チャンバーに取り付け、組織を沈めるのに十分なスクロース切断溶液を素早く注ぎます。組織ブロックの腹面をブレードに向けた後、ゆっくりとしたブレードの進行速度を使用して、腹側から背側までの厚さ350マイクロメートルのスライスを切ります。通常、半球ごとに7つのスライスを取得できます。
スライスをスライス収集チャンバーに移します。次に、収集チャンバーを摂氏34度の水浴に1時間入れてから、室温に戻します。脳の残りの部分をパラホルムアルデヒドに48時間入れます。
標的細胞を同定するには、スライスを記録チャンバーに入れ、スライスアンカーを使用して固定化します。低倍率で、赤外線照明を使用して、LECレイヤー5に移動します。次に、高倍率の水浸対物レンズに変更し、錐体ニューロンを特定します。
モニター上のセルの位置をテープでマークします。次に、全細胞パッチクランプを形成し、ホウケイ酸ガラスマイクロピペットを作製し、細胞内記録液を充填した。充填したマイクロピペットを電極ホルダーに入れ、電極ホルダーのサイドポートに接続されたマウスピースに強く吹き付けて陽圧を加えます。
メニスカスが形成されるように顕微鏡の対物レンズを持ち上げ、顕微鏡で見ることができるまで電極をメニスカスに挿入します。シールテストウィンドウを開き、ピペット抵抗が3〜5メガオームかどうかを確認します。次に、識別した細胞をピペットチップで触れ、細胞膜にくぼみが生じます。
次に、マウスピースで吸引して負圧を加え、ピペット抵抗を増加させます。細胞膜が破裂するまで徐々に負圧をかけ続け、細胞全体の静電容量過渡現象が発生します。現在のクランプ構成に入るには、フィルターキューブと適切な光学系を備えた顕微鏡の光路に向けられたLEDを使用し、40倍の対物レンズを介してスライスに光パルスを印加します。
シナプス前放出特性を調べるために、5ヘルツ、10ヘルツ、および20ヘルツで複数の光パルスの列を送達します。バイオシチンがニューロンを満たすことを可能にするために、細胞全体の構成に入った後少なくとも15分間待つ。電圧クランプでは、膜の容量と入力抵抗を監視します。
次に、細胞の体細胞から離れたアプローチ角度に沿ってピペットをゆっくりと引き出し、静電容量トランジェントと膜電流のゆっくりとした消失を観察し、細胞膜の再シールとピペットチップでのアウトサイドアウトパッチの形成を示します。スライスを24ウェルプレートのパラホルムアルデヒドに入れ、一晩インキュベートします。OCT培地を用いて、組織ブロックをクライオスタット標本ディスクに貼り付ける。
組織を凍結するには、イソペンタンを適切な容器に入れ、標本ディスクを沈め、組織がイソペンタンのレベルより上にあることを確認します。次に、イソペンタンの容器を液体窒素に下げ、組織を凍結させます。組織が完全に凍結したら、組織ブロックをマイナス20°Cのクライオスタットチャンバーに30分間放置して、ブロックの温度を平衡化させます。
平衡化後、クライオスタットで厚さ40マイクロメートルの切片を切り取り、細かい絵筆を使用して切片を刃から導きます。これらの凍結切片を室温のポリL−リジン被覆ガラス顕微鏡スライドに付着させ、該切片にスライドを接触させる。各スライドに150マイクロリットルの封入剤を加えた後、カバースリップを適用し、カバースリップを軽く押して気泡を取り除きます。
光退色から保護するためにスライドを覆い、12時間風乾させます。次に蛍光顕微鏡を用いて、ウイルス注入部位の位置を調べる。バイオサイトチン染色では、スライスをPBS中の3%過酸化水素中で30分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。
次に、酸素の泡が見えなくなるまで、脳スライスをPBSで洗います。次に、0.1%Triton X-100を含むPBS中の1%アビジンビオチン化HRP複合体溶液中でスライスを3時間インキュベートします。6回のPBS洗浄後、ニューロン構造のバイオシチン染色が見えるようになるまで、各スライスをDAB溶液中でインキュベートします。
スライスを冷たいPBSに移して反応を停止します。次に、ブラシを使用してスライスをガラス顕微鏡スライドに取り付けます。余分なPBSを除去した後、封入剤を追加します。
カバースリップを使用してスライスを覆い、前に示したように風乾させます。健康な錐体細胞が見つかり、パッチが適用されました。シナプス後細胞の同定が必要な場合は、蛍光マーカーを発現する細胞を広視野光学系を用いて局在化させる必要があります。
2ミリ秒の単一光パルスは、単純な波形光遺伝学的興奮性シナプス後電位をもたらした。シナプスの短期間の可塑性は、5、10、および20ヘルツの光刺激を適用することによって調べられます。長期可塑性を調べながら、コリン作動性アゴニストカルバコールを循環aCSFに10分間添加すると、リガンドを除去してから40分後にも明らかな長期のうつ病を引き起こしました。
注射部位の長さを組織学的に調べた。蛍光レポーターmCherryは、辺縁前皮質および下皮質のより深い層に局在していた。さらに、ビオシチン充填細胞を染色すると、その位置と形態が確認されました。
このプロトコルの重要なステップは、求心性脳領域の正確な形質導入であり、これは事後検証可能であり、急性スライスを準備する際の脳の迅速な解剖である。この手順は、特定の介在ニューロンサブクラスなどの個々の細胞型の蛍光標識と容易に組み合わせることができます。これを行うには、その特定の細胞型でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物を使用します。
ウイルス的に送達された光遺伝学的構築物は、システムおよび回路神経科学の分野で急速な進歩を可能にしました。
