Вирусно поставленные оптогенетические конструкции позволяют детально электрофизиологическую характеристику физиологии и пластичности специфических синапсов в острых срезах мозга. Основными преимуществами оптогенетической активации синапсов является способность изучать дальние пути и селективная стимуляция аксонов, которые анатомически не разделены. Продемонстрировать процедуру будет доктор Лиза Киннаване, научный сотрудник нашей лаборатории.
Для начала загрузите шприц Гамильтона в микроинъекционный шприцевой насос, прикрепленный к подвижному рычагу, установленному на стереотаксической раме. Затем поместите пятимикролитровую аликвоту вируса в микроцентрифугу. Раскрутите трубку в течение нескольких секунд и выпейте два микролитра вирусного препарата в крышку трубки.
Чтобы заполнить шприц вирусным препаратом, осмотрите кончик иглы хирургическим микроскопом. Затем вручную поместите болюс вируса на кончик иглы и извлеките шприц-плунжер с помощью органов управления насосом. Установите объем впрыска насоса на 300 нанолитров, а расход на 100 нанолитров в минуту.
Запустите насос и подтвердите правильное течение, наблюдая за каплей вируса на кончике иглы. Впитать вирус на ватную палочку и очистить иглу 70% этанолом. Затем, используя винты регулятора на стереотаксической раме, переместите кончик иглы к брегме и обратите внимание на стереотаксические измерения, наблюдаемые на трех шкалах Вернье на раме.
Сложите или вычтите эти расстояния из координат брегмы. Сделайте отверстие для заусенцев на поверхности черепа с помощью микро-сверла, установленного на стереотаксической руке. Вводят иглу в мозг по заданной дорсовентральной координате и вводят заданный объем вирусного препарата.
После инфузии оставьте иглу in situ в течение 10 минут, чтобы обеспечить диффузию болюса. Затем извлеките иглу и запустите насос, чтобы убедиться, что игла не заблокирована. Через две недели после вирусной инъекции усыпьте крысу, быстро рассекните весь мозг и перенесите его в раствор для резки сахарозы.
Используя металлическую чайную ложку, поднимите мозг, выбросьте лишний раствор и поместите его на фильтровальную бумагу. С помощью скальпеля удалите мозжечок и разрезайте головной мозг в корональной плоскости примерно на полпути по его длине. Задняя половина представляет собой тканевый блок LEC.
Верните тканевый блок и оставшийся мозг в раствор для резки сахарозы. Затем поместите каплю цианоакрилатного клея на стадию вибратома и распределите ее тонким слоем. Затем, используя чайную ложку, выберите блок ткани LEC и перенесите его на клеевой пластырь, чтобы передний корональный разрез прилип.
Установите сцену в тканевую камеру вибратома и быстро залейте достаточное количество раствора для резки сахарозы, чтобы погрузить ткань. После ориентации вентральной поверхности тканевого блока в сторону лезвия отрежьте срезы толщиной 350 микрометров от вентрального до дорсального, используя медленную скорость продвижения лезвия. Как правило, на полушарие можно получить семь срезов.
Перенесите ломтики в камеру сбора ломтиков. Затем поместите камеру сбора на водяную баню с температурой 34 градуса Цельсия на один час, прежде чем вернуться к комнатной температуре. Поместите оставшуюся часть мозга в параформальдегид на 48 часов.
Для идентификации целевой ячейки поместите срез в камеру записи и обездвижите его с помощью привязки среза. При низком увеличении, используя инфракрасную подсветку, перейдите к пятому слою LEC. Затем перейдите к высокому увеличению объектива погружения в воду и определите пирамидальные нейроны.
Пометьте положение ячейки на мониторе лентой. Затем, чтобы сформировать зажим для целой клетки, изготовьте микропипетку из боросиликатного стекла и заполните ее внутриклеточным регистрирующим раствором. Поместите заполненную микропипетку в держатель электрода и подайте положительное давление, сильно вдавливая мундштук, подключенный к боковому порту держателя электрода.
Поднимите объектив микроскопа так, чтобы образовался мениск, и вставьте электрод в мениск, пока его не увидят на микроскопе. Откройте окно Seal Test и определите, составляет ли сопротивление пипетки от трех до пяти мегаом. Затем коснитесь идентифицированной клетки кончиком пипетки, в результате чего образуется углубление в клеточной мембране.
Далее применяют отрицательное давление путем всасывания на мундштук, увеличивая сопротивление пипетки. Продолжайте применять отрицательное давление постепенно, пока клеточная мембрана не разорвется, что приведет к переходным процессам емкости целой клетки. Чтобы войти в текущую конфигурацию зажима, используйте установленный светодиод, направленный в световой контур микроскопа с кубами фильтра и соответствующей оптикой, и подайте световые импульсы на срез через объектив 40X.
Доставляйте ряды нескольких световых импульсов при пяти герцах, 10 герцах и 20 герцах для исследования свойств пресинаптического высвобождения. Чтобы биоцитин заполнил нейрон, подождите не менее 15 минут после входа во всю клеточную конфигурацию. В зажиме напряжения контролируйте емкость мембраны и входное сопротивление.
Затем медленно отведите пипетку вдоль угла подхода подальше от сомы клетки, наблюдая медленное исчезновение емкостных переходных процессов и мембранного тока, что указывает на повторное уплотнение клеточной мембраны и образование внешнего пятна на кончике пипетки. Поместите ломтик в параформальдегид в 24-луночную пластину и инкубируйте в течение ночи. Используя среду OCT, прикрепите тканевый блок к диску образца криостата.
Чтобы заморозить ткань, поместите изопентан в соответствующий контейнер и погрузите диск образца, гарантируя, что ткань находится выше уровня изопентана. Затем опустите контейнер изопентана в жидкий азот и дайте ткани замерзнуть. Как только ткань полностью замерзнет, оставьте тканевый блок в криостатной камере при минус 20 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы температура блока уравновешивалась.
После уравновешивания отрежьте участки толщиной 40 микрометров в криостате и используйте тонкую кисть, чтобы направить секции от лезвия. Прикрепите эти замороженные участки к стеклянному микроскопу с покрытием из поли-L-лизина комнатной температуры, прикоснувшись затвором к секциям. После добавления 150 микролитров монтажной среды к каждому слайду нанесите крышку и удалите пузырьки воздуха, осторожно надавливая на крышку.
Накройте слайды для защиты от фотоотбеливания и дайте им высохнуть на воздухе в течение 12 часов. Затем с помощью флуоресцентного микроскопа исследуют расположение места инъекции вируса. Для окрашивания биоцитином инкубируйте ломтики в 3% перекиси водорода в PBS в течение 30 минут, чтобы блокировать любую эндогенную активность пероксидазы.
Затем промывайте кусочки мозга PBS до тех пор, пока не будут видны новые пузырьки кислорода. Далее инкубируют ломтики в течение трех часов в 1%-авидин-биотинилированном комплексном растворе HRP в PBS, содержащем 0,1%-тритона X-100. После шести промывок PBS инкубируйте каждый срез в растворе DAB до тех пор, пока не станет видно окрашивание биоцитином нейронных структур.
Остановите реакцию, перенеся срезы в холодный PBS. Затем установите срезы на предметные стекла микроскопа с помощью кисти. После удаления излишков PBS добавьте монтажную среду.
Накройте ломтики, используя крышки, и дайте им высохнуть на воздухе, как показано ранее. Здоровая пирамидальная клетка была найдена и залатана. Если требуется постсинаптическая идентификация клеток, клетка, экспрессирующая флуоресцентный маркер, должна быть локализована с использованием широкоугольной оптики.
Одиночные световые импульсы в две миллисекунды приводили к простым волновым оптогенетическим возбуждающим постсинаптическим потенциалам. Кратковременную пластичность синапса исследуют путем применения пяти, 10 и 20 герцовых ходов световой стимуляции. При исследовании долгосрочной пластичности добавление холинергического агониста карбахола в циркулирующий aCSF в течение 10 минут вызывало долгосрочную депрессию, которая все еще была очевидна через 40 минут после удаления лиганда.
Длину места инъекции исследовали гистологически. Флуоресцентный репортер mCherry был локализован в более глубоких слоях прелимбической и инфракрасной коры. Кроме того, окрашивание заполненной биоцитином клетки подтвердило ее местоположение и морфологию.
Критическими шагами этого протокола являются точная трансдукция афферентной области мозга, которая может быть проверена post hoc, и быстрое рассечение мозга при приготовлении острых срезов. Эта процедура легко сочетается с флуоресцентной маркировкой отдельного типа клеток, таких как определенный подкласс интернейрона. Для этого мы бы использовали трансгенное животное, которое экспрессирует рекомбиназу в этом конкретном типе клеток.
Вирусно доставленные оптогенетические конструкции позволили быстро продвинуться в области систем и нейронауки схем.
