Viral olarak verilen optogenetik yapılar, akut beyin dilimlerinde spesifik sinapsların fizyolojisinin ve plastisitesinin ayrıntılı elektrofizyolojik karakterizasyonuna izin verir. Sinapsları optogenetik olarak aktive etmenin başlıca avantajları, uzun menzilli yolları inceleme yeteneği ve anatomik olarak ayrılmamış aksonların seçici uyarımıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Dr. Lisa Kinnavane olacaktır.
Başlamak için, bir Hamilton şırıngasını stereotaksik bir çerçeveye monte edilmiş hareketli bir kola bağlı bir mikroenjeksiyon şırınga pompasına yükleyin. Daha sonra virüsün beş mikrolitrelik bir alikotunu bir mikrosantrifüje yerleştirin. Tüpü birkaç saniye döndürün ve viral preparatın iki mikrolitresini tüpün kapağına pipetleyin.
Şırıngayı viral preparatla doldurmak için, iğne ucunu cerrahi mikroskopla görüntüleyin. Ardından, virüsün bolusunu manuel olarak iğnenin ucuna yerleştirin ve pompa kontrollerini kullanarak şırınga pistonunu geri çekin. Pompa enjeksiyon hacmini 300 nanolitreye ve akış hızını dakikada 100 nanolitreye ayarlayın.
Pompayı çalıştırın ve iğne ucundaki virüs damlacığını gözlemleyerek doğru akışı onaylayın. Virüsü bir pamuk tomurcuğu üzerinde emin ve iğneyi% 70 etanol ile temizleyin. Daha sonra, stereotaksik çerçeve üzerindeki ayarlayıcı vidaları kullanarak, iğne ucunu bregmaya yönlendirin ve çerçeve üzerindeki üç vernier ölçeğinde gözlenen stereotaksik ölçümleri not alın.
Bu mesafeleri bregma koordinatlarına ekleyin veya buradan çıkarın. Stereotaksik kola monte edilmiş bir mikro matkap kullanarak kafatası yüzeyinde bir çapak deliği açın. İğneyi önceden belirlenmiş dorsoventral koordinatta beyne yerleştirin ve viral preparatın önceden belirlenmiş bir hacmini infüze edin.
İnfüzyondan sonra, bolusun difüzyonuna izin vermek için iğneyi 10 dakika yerinde bırakın. Ardından iğneyi çıkarın ve iğnenin tıkanmadığından emin olmak için pompayı çalıştırın. Viral enjeksiyondan iki hafta sonra, sıçanı ötenazileştirin, tüm beyni hızla disseke edin ve sakkaroz kesme çözeltisine aktarın.
Metal bir çay kaşığı kullanarak beyni alın, fazla çözeltiyi atın ve bir filtre kağıdına yerleştirin. Bir neşter kullanarak, beyinciği çıkarın ve koronal düzlemdeki beyincikleri uzunluğu boyunca yaklaşık yarısı kadar kesin. Arka yarısı LEC doku bloğudur.
Doku bloğunu ve kalan beyni sakkaroz kesme çözeltisine geri döndürün. Daha sonra, bir vibratom aşamasına bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin ve ince bir tabakaya yayın. Daha sonra bir çay kaşığı kullanarak, LEC doku bloğunu seçin ve ön koronal kesimin yapışacağı şekilde tutkal yamasına aktarın.
Aşamayı vibratom doku odasına takın ve dokuyu batırmak için yeterli sakkaroz kesme çözeltisini hızla dökün. Doku bloğunun ventral yüzeyini bıçağa doğru yönlendirdikten sonra, yavaş bir bıçak ilerleme hızı kullanarak ventralden sırta 350 mikrometre kalınlığındaki dilimleri kesin. Tipik olarak, yarımküre başına yedi dilim elde edilebilir.
Dilimleri dilim toplama odasına aktarın. Ardından, oda sıcaklığına dönmeden önce toplama odasını bir saat boyunca 34 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Beynin geri kalanını 48 saat boyunca paraformaldehit içine yerleştirin.
Hedef hücre tanımlaması için, dilimi kayıt odasına yerleştirin ve bir dilim ankrajı kullanarak hareketsiz hale getirin. Düşük büyütme altında, kızılötesi aydınlatma kullanarak, LEC beşinci katmanına gidin. Daha sonra yüksek büyütmeli suya daldırma hedefine geçin ve piramidal nöronları tanımlayın.
Hücrenin monitördeki konumunu bantla işaretleyin. Daha sonra, bütün bir hücre yaması kelepçesi oluşturmak için, bir borosilikat cam mikro pipet imal edin ve hücre içi kayıt çözeltisi ile doldurun. Doldurulmuş mikro pipeti elektrot tutucuya yerleştirin ve elektrot tutucu yan portuna bağlı bir ağızlığa sert üfleyerek pozitif basınç uygulayın.
Mikroskop hedefini bir menisküs oluşturacak şekilde yükseltin ve elektrodu mikroskopta görülene kadar menisküsün içine yerleştirin. Sızdırmazlık Testi penceresini açın ve pipet direncinin üç ila beş megaohm olup olmadığını belirleyin. Ardından, tanımlanan hücreye bir pipet ucuyla dokunun ve hücre zarında girinti oluşmasına neden olun.
Daha sonra, ağızlıkta emme yoluyla negatif basınç uygulayın ve pipet direncini artırın. Hücre zarı yırtılana kadar negatif basıncı kademeli olarak uygulamaya devam edin, bu da tüm hücre kapasitans geçicilerine neden olur. Mevcut kelepçe konfigürasyonuna girmek için, filtre küpleri ve uygun optiklerle mikroskop ışık yoluna yönlendirilmiş monte edilmiş bir LED kullanın ve 40X hedefi aracılığıyla dilime ışık darbeleri uygulayın.
Presinaptik salınım özelliklerini araştırmak için beş hertz, 10 hertz ve 20 hertz'de çoklu ışık darbeli trenler teslim edin. Biyositinin nöronu doldurmasına izin vermek için, tüm hücre konfigürasyonuna girdikten sonra en az 15 dakika bekleyin. Voltaj kelepçesinde, membran kapasitansını ve giriş direncini izleyin.
Ardından, yaklaşma açısı boyunca pipeti yavaşça hücrenin somasından uzağa çekin, kapasitans geçicilerinin ve membran akımının yavaş yavaş kaybolduğunu gözlemleyerek hücre zarının yeniden kapatıldığını ve pipet ucunda bir dıştan-dışarı yama oluşumunu gösterir. Dilimi 24 delikli bir plakada paraformaldehit içine yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. OCT ortamını kullanarak, kriyostat numune diskine bir doku bloğu takın.
Dokuyu dondurmak için, isopentanı uygun bir kaba yerleştirin ve numune diskini batırarak dokunun izopentan seviyesinin üzerinde olmasını sağlayın. Daha sonra izopentan kabını sıvı azota indirin ve dokunun donmasına izin verin. Doku tamamen donduktan sonra, bloğun sıcaklığının dengelenmesine izin vermek için doku bloğunu kriyostat odasında eksi 20 santigrat derecede 30 dakika bekletin.
Dengelemeden sonra, kriyostattaki 40 mikrometre kalınlığındaki bölümleri kesin ve bölümleri bıçaktan çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Bu dondurulmuş bölümleri, slaytı bölümlere dokunarak oda sıcaklığında poli-L-lizin kaplı cam mikroskop slaydına yapıştırın. Her kızağa 150 mikrolitre montaj ortamı ekledikten sonra, kapak kaymasını uygulayın ve kapak kaymasına hafifçe bastırarak hava kabarcıklarını çıkarın.
Fotobeyazlatmaya karşı korumak için slaytları örtün ve 12 saat boyunca havada kurumasını bekleyin. Daha sonra bir floresan mikroskobu kullanarak, viral enjeksiyon bölgesinin yerini inceleyin. Biyositin boyama için, herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için dilimleri PBS'de% 3 hidrojen peroksit içinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra beyin dilimlerini PBS ile daha fazla oksijen kabarcığı görünmeyene kadar yıkayın. Daha sonra, dilimleri% 0.1 Triton X-100 içeren PBS'de% 1avidin-biyotinile HRP kompleks çözeltisinde% 1 avidin-biyotinile HRP kompleks çözeltisinde üç saat boyunca inkübe edin. Altı PBS yıkandıktan sonra, nöronal yapıların biyositin boyaması görünür hale gelene kadar her bir dilimi DAB çözeltisinde inkübe edin.
Dilimleri soğuk PBS'ye aktararak reaksiyonu durdurun. Daha sonra dilimleri bir fırça kullanarak cam mikroskop slaytlarına monte edin. Fazla PBS'yi çıkardıktan sonra, montaj ortamı ekleyin.
Dilimleri kapak fişlerini kullanarak örtün ve daha önce gösterildiği gibi havayla kurumasını bekleyin. Sağlıklı bir piramidal hücre yerleştirildi ve yamalandı. Post-sinaptik hücre tanımlaması gerekiyorsa, floresan belirteci eksprese eden bir hücre, geniş alan optikleri kullanılarak lokalize edilmelidir.
İki milisaniyelik tek ışık darbeleri, basit dalga formu optogenetik uyarıcı post-sinaptik potansiyellerle sonuçlandı. Sinapsın kısa süreli plastisitesi, beş, 10 ve 20 hertz ışık stimülasyon trenleri uygulanarak incelenir. Uzun süreli plastisiteyi araştırırken, 10 dakika boyunca dolaşımdaki aCSF'ye kolinerjik agonist karbaçol eklenmesi, ligandın çıkarılmasından 40 dakika sonra hala belirgin olan uzun süreli bir depresyona neden oldu.
Enjeksiyon bölgesinin uzunluğu histolojik olarak incelendi. Floresan muhabir mCherry, prelimbik ve infralimbik korteksin daha derin katmanlarına lokalize edildi. Ayrıca, biyositin dolu bir hücrenin boyanması, yerini ve morfolojisini doğruladı.
Bu protokolün kritik adımları, post hoc olarak doğrulanabilen afferent beyin bölgesinin doğru bir şekilde iletilmesi ve akut dilimler hazırlanırken beynin hızlı diseksiyonudur. Bu prosedür, belirli bir internöron alt sınıfı gibi bireysel bir hücre tipinin floresan etiketlemesi ile kolayca birleştirilir. Bunu yapmak için, belirli bir hücre tipinde bir rekombinazı ifade eden transgenik bir hayvan kullanacağız.
Viral olarak verilen optogenetik yapılar, sistemler ve devre sinirbilimi alanlarında hızlı ilerlemelere izin vermiştir.
