I costrutti optogenetici consegnati viralmente consentono una caratterizzazione elettrofisiologica dettagliata della fisiologia e della plasticità di sinapsi specifiche in fette cerebrali acute. I principali vantaggi dell'attivazione delle sinapsi optogeneticamente è la capacità di studiare percorsi a lungo raggio e la stimolazione selettiva degli assoni che non sono anatomicamente separati. A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Lisa Kinnavane, ricercatrice associata del nostro laboratorio.
Per iniziare, caricare una siringa Hamilton in una pompa a siringa a microiniezione collegata a un braccio mobile montato su un telaio stereotassico. Quindi mettere un'aliquota da cinque microlitri del virus in una microcentrifuga. Girare il tubo per alcuni secondi e pipettare due microlitri del preparato virale nel coperchio del tubo.
Per riempire la siringa con la preparazione virale, visualizzare la punta dell'ago con un microscopio chirurgico. Quindi posizionare manualmente il bolo del virus sulla punta dell'ago e ritirare lo stantuffo della siringa utilizzando i comandi della pompa. Impostare il volume di iniezione della pompa su 300 nanolitri e la portata su 100 nanolitri al minuto.
Eseguire la pompa e confermare il flusso corretto osservando la goccia del virus sulla punta dell'ago. Assorbire il virus su un batuffolo di cotone e pulire l'ago con etanolo al 70%. Successivamente, utilizzando le viti di regolazione sul telaio stereotassico, spostare la punta dell'ago verso il bregma e prendere nota delle misurazioni stereotassiche osservate sulle tre scale di vernier sul telaio.
Aggiungere o sottrarre queste distanze dalle coordinate del bregma. Fai un foro di bava sulla superficie del cranio usando un micro-trapano montato sul braccio stereotassico. Inserire l'ago nel cervello alla coordinata dorsoventrale predeterminata e infondere un volume predeterminato della preparazione virale.
Dopo l'infusione, lasciare l'ago in situ per 10 minuti per consentire la diffusione del bolo. Quindi rimuovere l'ago e far funzionare la pompa per assicurarsi che l'ago non sia bloccato. Due settimane dopo l'iniezione virale, eutanasia il ratto, sezionare rapidamente l'intero cervello e trasferirlo nella soluzione di taglio di saccarosio.
Usando un cucchiaino di metallo, raccogli il cervello, scarta la soluzione in eccesso e mettila su una carta da filtro. Usando un bisturi, rimuovere il cervelletto e tagliare il cervello nel piano coronale circa a metà della sua lunghezza. La metà posteriore è il blocco di tessuto LEC.
Riportare il blocco di tessuto e il cervello rimanente alla soluzione di taglio di saccarosio. Quindi, posizionare una goccia di colla cianoacrilica su uno stadio di vibratomo e distribuirlo in uno strato sottile. Quindi, usando un cucchiaino, raccogliere il blocco di tessuto LEC e trasferirlo sul cerotto di colla, in modo che il taglio coronale anteriore abbia aderito.
Installare il palcoscenico nella camera del tessuto vibratomo e versare rapidamente una soluzione di taglio di saccarosio sufficiente per immergere il tessuto. Dopo aver orientato la superficie ventrale del blocco di tessuto verso la lama, tagliare fette spesse 350 micrometri da ventrali a dorsali usando una velocità di avanzamento della lama lenta. In genere, è possibile ottenere sette fette per emisfero.
Trasferire le fette nella camera di raccolta delle fette. Quindi posizionare la camera di raccolta in un bagno d'acqua a 34 gradi Celsius per un'ora prima di tornare a temperatura ambiente. Metti il resto del cervello in paraformaldeide per 48 ore.
Per l'identificazione della cella bersaglio, posizionare la fetta nella camera di registrazione e immobilizzarla utilizzando un'ancora di fetta. Con un basso ingrandimento, utilizzando l'illuminazione a infrarossi, passare al livello cinque LEC. Quindi passare all'obiettivo di immersione in acqua ad alto ingrandimento e identificare i neuroni piramidali.
Contrassegnare la posizione della cella sul monitor con del nastro adesivo. Successivamente, per formare un morsetto per cerotti a cellule intere, fabbricare una micro-pipetta in vetro borosilicato e riempirla con una soluzione di registrazione intracellulare. Posizionare la micropipetta riempita nel supporto dell'elettrodo e applicare una pressione positiva soffiando con forza in un boccaglio collegato alla porta laterale del supporto dell'elettrodo.
Sollevare l'obiettivo del microscopio in modo tale che si formi un menisco e inserire l'elettrodo nel menisco fino a quando non può essere visto sul microscopio. Aprire la finestra Seal Test e determinare se la resistenza della pipetta è compresa tra tre e cinque megaohm. Quindi toccare la cellula identificata con una punta di pipetta, con conseguente rientranza nella membrana cellulare.
Quindi, applicare una pressione negativa mediante aspirazione al boccaglio, aumentando la resistenza della pipetta. Continuare ad applicare gradualmente la pressione negativa fino a quando la membrana cellulare si rompe, causando transitori di capacità dell'intera cellula. Per accedere alla configurazione corrente del morsetto, utilizzare un LED montato diretto nel percorso della luce del microscopio con cubi filtranti e ottiche appropriate e applicare impulsi luminosi alla fetta tramite l'obiettivo 40X.
Fornire treni di impulsi luminosi multipli a cinque hertz, 10 hertz e 20 hertz per studiare le proprietà di rilascio presinaptico. Per consentire alla biocitina di riempire il neurone, attendere almeno 15 minuti dopo aver inserito l'intera configurazione cellulare. Nel morsetto di tensione, monitorare la capacità della membrana e la resistenza di ingresso.
Quindi ritirare lentamente la pipetta lungo l'angolo di attacco lontano dal soma della cellula, osservando la lenta scomparsa dei transitori di capacità e della corrente di membrana, indicando la risigillatura della membrana cellulare e la formazione di una patch esterna-esterna sulla punta della pipetta. Mettere la fetta in paraformaldeide in una piastra da 24 pozzetti e incubare durante la notte. Utilizzando il mezzo OCT, attaccare un blocco di tessuto al disco del campione di criostato.
Per congelare il tessuto, posizionare l'isopentano in un contenitore appropriato e immergere il disco del campione, assicurandosi che il tessuto sia al di sopra del livello dell'isopentano. Quindi abbassare il contenitore di isopentano in azoto liquido e lasciare congelare il tessuto. Una volta che il tessuto è completamente congelato, lasciare il blocco di tessuto nella camera del criostato a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti per consentire alla temperatura del blocco di equilibrarsi.
Dopo l'equilibrio, tagliare sezioni spesse 40 micrometri nel criostato e utilizzare un pennello fine per guidare le sezioni dalla lama. Far aderire queste sezioni congelate a un vetrino da microscopio rivestito di poli-L-lisina a temperatura ambiente toccando il vetrino sulle sezioni. Dopo aver aggiunto 150 microlitri di supporto di montaggio a ciascuna diapositiva, applicare il vetrino di copertura e rimuovere eventuali bolle d'aria premendo delicatamente sul vetrino di copertura.
Coprire i vetrini per proteggerli dal fotosbiancamento e lasciarli asciugare all'aria per 12 ore. Quindi, utilizzando un microscopio a fluorescenza, esaminare la posizione del sito di iniezione virale. Per la colorazione della biocitina, incubare le fette in perossido di idrogeno al 3% in PBS per 30 minuti per bloccare qualsiasi attività endogena della perossidasi.
Quindi lavare le fette di cervello con PBS fino a quando non sono visibili ulteriori bolle di ossigeno. Quindi, incubare le fette per tre ore in una soluzione complessa HRP all'1% avidina-biotinilata in PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100. Dopo sei lavaggi PBS, incubare ogni fetta in soluzione DAB fino a quando la colorazione della biocitina delle strutture neuronali diventa visibile.
Interrompere la reazione trasferendo le fette in PBS freddo. Quindi montare le fette sui vetrini del microscopio di vetro usando un pennello. Dopo aver rimosso il PBS in eccesso, aggiungere il mezzo di montaggio.
Coprire le fette con dei foglietti di copertura e lasciarle asciugare all'aria, come dimostrato in precedenza. Una cellula piramidale sana è stata localizzata e rattoppata. Se è richiesta l'identificazione delle cellule post-sinaptiche, una cellula che esprime il marcatore fluorescente deve essere localizzata utilizzando l'ottica a campo largo.
Singoli impulsi luminosi di due millisecondi hanno portato a semplici potenziali post-sinaptici eccitatori optogenetici della forma d'onda. La plasticità a breve termine della sinapsi viene esaminata applicando treni di stimolazione luminosa a cinque, 10 e 20 hertz. Durante lo studio della plasticità a lungo termine, l'aggiunta di carbacholo agonista colinergico all'aCSF circolante per 10 minuti ha causato una depressione a lungo termine che era ancora evidente 40 minuti dopo la rimozione del ligando.
La lunghezza del sito di iniezione è stata esaminata istologicamente. Il reporter fluorescente mCherry è stato localizzato negli strati più profondi della corteccia prelimbica e infralimbica. Inoltre, la colorazione di una cellula piena di biocitina ha confermato la sua posizione e morfologia.
I passaggi critici di questo protocollo sono la trasduzione accurata della regione afferente del cervello, che può essere verificata post hoc, e la rapida dissezione del cervello durante la preparazione di fette acute. Questa procedura è facilmente combinata con l'etichettatura fluorescente di un singolo tipo di cellula, come una particolare sottoclasse di interneuroni. Per fare questo, useremmo un animale transgenico che esprime una ricombinasi in quel particolare tipo di cellula.
I costrutti optogenetici consegnati viralmente hanno permesso rapidi progressi nei campi delle neuroscienze dei sistemi e dei circuiti.
