びまん性正中線神経膠腫は、浸潤性の高い脳腫瘍です。この方法は、DMG細胞がどのように移動および侵入するかを3Dコンテキストでリアルタイムで研究し、重要な接着分子の潜在的な役割に関する特定の洞察を得るのに役立ちます。標識試薬と抗CD44特異的抗体を用いることで、DMG細胞上の原形質膜上のCD44の発現を3D遊走・浸潤においても生細胞イメージングにより研究することができます。
この技術の適用は、これらの細胞の運動性におけるCD44の潜在的な役割を強調し、それが貴重で侵襲的な分子標的を表す可能性があることを示唆しています。まず、100マイクロリットルの滅菌水を加えてALRを再水和し、ピペッティングで溶液を混合します。丸底マルチウェルプレートまたは琥珀色のチューブでTSM培地中のALRと抗体を混合し、光から保護します。
ウェルあたり25マイクロリットルを最終アッセイ濃度の3倍で分注するのに十分な量の培地を調製し、室温で15分間インキュベートします。TSM培地でBSRを1.5ミリモル濃度で希釈し、アッセイ終了時に0.5ミリモルの最終濃度を得た。次に、NSが置かれているウェルの底に触れないようにし、NSの存在を目視で確認しながら、各ウェルから75マイクロリットルの培地を穏やかかつゆっくりと取り出します。
25マイクロリットルのBSRおよびALR抗体複合体を各ウェルに穏やかに添加し、ALR抗体複合体を培地と2〜3分間混合させます。倒立顕微鏡を使用して、各NSがウェルの底の中央に配置されていることを確認します。針を使用して気泡を除去することにより、気泡の形成を回避します。
プレートを氷の上に5分間置き、プレートの底を冷たくします。予冷したP200チップをウェルの内壁に配置し、気泡の形成を避け、ウェルの底に触れることにより、ウェルあたり75マイクロリットルのBMMを分注します。プレートを氷の上に5分間置いて、BMMを培地と混合させます。
倒立顕微鏡を用いて、NSの位置を確認します。また、中央に存在しない場合は、プレートを摂氏4度で180倍Gで5分間遠心分離します。次に、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%に設定されたインキュベーター内に置かれた生細胞分析装置にプレートを移します。ウェルがBMMでコーティングされたら、P200チップを切断します。
選択した各ウェルから50マイクロリットルの細胞培地とNSを取り出し、コーティングされた平底ウェルに移します。各ウェルにおけるNSの存在及び位置を目視で確認する。希釈したBSRおよびALR抗体50マイクロリットルを各ウェルに静かに加え、試薬が混合されるまで2〜3分待ちます。
また、倒立顕微鏡を使用して、複製NSのほとんどがウェルの中央に配置されていることを確認します。気泡がないことを確認した後、前述のように、生細胞分析装置にプレートを静かに移します。生細胞解析装置ソフトウェアで、取得するスケジュールオプションを選択し、プラスタブをクリックしてスキャンオンスケジュールを選択し、テキスト原稿に記載されている間隔でプレートをスキャンします。
ソフトウェアウィンドウで、船舶を作成または復元し、[新規]オプションをクリックします。スフェロイドスキャンタイプ、位相と明視野、侵襲アッセイ用の緑色の画像チャンネル、および4X対物レンズを選択します。希釈クローニングスキャン、タイプ4X対物レンズ、および移行アッセイ用のフェーズとグリーンを選択します。
プレートタイプを選択し、プレートマップ上でスキャンするウェルを強調表示して定義し、スキャン頻度を設定します。[スケジュールに追加]をクリックして、スキャンを開始します。[新しい解析定義の作成]タブを選択します。
次に、タブでそれぞれ侵入と移動のためのスフェロイド侵入または基本的なアナライザーアプリケーションを選択します。イメージ チャネルで侵入および移行に適したチャネルを選択します。3 つから 4 つのウェルからいくつかの代表的な画像を選択して、解析設定をプレビューおよび調整します。
浸潤アッセイでは、解析定義タブで、明視野チャンネルとグリーンチャンネルのアプリケーション設定をテキスト原稿に記載されている設定で調整し、スフェロイド細胞と浸潤細胞の間に正確なセグメンテーションを生成します。遊走アッセイでは、フェーズチャネルとグリーンチャンネルのテキスト原稿に記載されているようにアプリケーション設定を調整して、コンフルエンスセルとグリーンセルの間に正確なセグメンテーションを生成します。複数のウェルをランダムにクリックして、NSの分析設定が正しいことを確認します。
分析するウェルと時点を選択します。解析定義を保存し、[完了]をクリックします。初代DMG患者由来の細胞におけるCD44発現の代表的な免疫蛍光共焦点画像は、細胞の移動および浸潤におけるCD44の役割を実証した。
ライブ3D細胞免疫化学により、CD44発現を視覚化することができます。遊走と浸潤の両方の時間経過の代表的なフレームは、経時的に観察された同じ細胞上の緑色蛍光シグナルの有無を示しており、細胞が遊走および浸潤している間、CD44の発現がオンとオフであることを示唆しています。遊走および浸潤過程を96時間にわたって追跡し、高レベルのCD44を有するQCTB-R059細胞を示す。
CD44発現の定量化および経時的なその増加は、遊走および浸潤の両方についてALRに関連する全体的な緑色蛍光シグナルによって測定された。抗CD44抗体を生細胞に使用すると、細胞形態に影響を及ぼし、間葉様からアメーバ様の浸潤への移行を誘導し、これらの細胞の浸潤および遊走能力を低下させます。この方法の最も重要なステップは、標識試薬と抗体の混合、マトリゲルおよび培地への混合物の添加、および生細胞イメージング装置へのアクセスです。
この方法は、直接細胞および接触によって媒介されるDMG細胞相互作用を調べるために2つ以上の特徴的な標識試薬および抗体を使用することによってさらに実施することができる。私たちの方法は、DMGの移動と侵入の細胞および分子メカニズムを3Dで調査するための新しいツールを提供し、それらの浸潤表現型を阻害するための新しい方向性を提供します。
