デジタル空間プロファイリング(DSP)は、空間的に層別化されたタンパク質定量のための効率的な方法を提供します。その実装により、腫瘍と微小環境の異なる領域にわたるタンパク質発現を特徴付けることができます。DSPの重要な機能は、高スループットのデータ処理を可能にする多重化機能です。
カスタマイズされた対象領域を定義する機能により、データ分析に空間的次元がさらに提供されます。DSPは、空間的に定量するタンパク質またはRNA発現が病理学的または生理学的プロセスの解明に役立つ可能性のあるあらゆるサンプルに適用できます。これは、地域の標的変動が悪性の成長または浸潤と相関する可能性がある腫瘍学に特に関連しています。
手順を実演するのは、組織技術者のスコット・パリソウルとゲノム技術者のレイチェル・バーニーです。スライドを準備するには、まず、各生検からいくつかの2ミリメートルコアを取り出し、それらを単一の組織マイクロアレイブロックに入れます。ブロックから4ミクロンの切片を切り取り、スライドガラスに取り付けます。
各スライドをスライドホルダーガスケットの内側に置き、摂氏60度で30分間インキュベートします。半自動IHCシステムでは、スライドあたり150マイクロリットルの洗浄バッファーと5ミリリットルのデッドボリュームを位置1の容器に充填し、蓋を開けたままにします。同量のブロッキング溶液を容器の位置2に充填する。
試薬容器トレイを機械にロードします。[IHC の処理] を選択し、[マーカー] フィールドのドロップダウン ボックスでソリューション名をブロックする を選択します。すべてのスライドが終了したら、[閉じる]をクリックします。
次に、[ラベルの印刷]をクリックし、[まだ印刷されていないすべてのスライドラベル]をオンにして、[印刷]をクリックします。スライドの上部にラベルを貼り付けます。スライドをスライドトレイにセットし、サンプルとラベルが上向きであることを確認します。
LEDボタンを押してトレイを下げ、機器がスライドのスキャンと認識を開始できるようにします。[開始] ボタンをクリックして、実験を開始します。実行が完了したら、LEDボタンが緑色に点滅したらを押します。
トレイを機器から取り外し、各スライドからカバータイルを慎重に持ち上げます。スライドを1Xリン酸緩衝生理食塩水に入れます。余分なバッファーを取り除き、疎水性ペンで各組織切片の輪郭を描き、疎水性バリアを作成します。
スライドごとに8マイクロリットルの各抗体を添加し、バッファーWを使用して最終容量200マイクロリットルに到達することにより、抗体PCオリゴ溶液を作成します。次に、抗体PCオリゴ溶液をスライドに塗布し、スライドを摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、スライドを加湿トレイに入れ、1X TBSTで10分間3回洗浄します。
室温で4%パラホルムアルデヒドで30分間ポストフィックスした後、1X TBSTで5分間2回洗浄します。SYTO 13核染色剤を室温で15分間加えた後、1X TBSTで2回洗浄します。コントロールセンターのデータ収集の上にマウスを置き、[新規]または[実行の続行]を選択します。
ラベルをユーザーの方に向けてスライドホルダーにスライドを置きます。スライドトレイクランプを下げ、細長い窓に組織が見えるようにします。6ミリリットルのバッファSを追加します。コントロールセンターの画面の指示に従います。
xスライダーとyスライダーを使用して異なる軸間をズームし、スキャンする領域を描画します。[スキャン]を選択し、定義されたターゲット領域全体が画像化されるまでスキャンを続行します。20倍の画像を生成します。
各組織コアに対して直径250マイクロメートルの3つの等しいサイズの円形ROIを選択して、ROIを定義します。ROI を承認するには、[スキャン ワークスペースの終了] ボタンをクリックします。次に、UV光が抗体からオリゴを切断するのを待ちます。
クリーニング機器のプロセスが完了したら、[新しいデータ収集]を選択して、現在のスライドまたはプレートを続行します。プレートアイコン領域をダブルクリックして、完成したプレートウィンドウを開きます。ハイブリダイゼーションコードパックのロット番号を入力し、[更新]をクリックします。
次に、[確定]をクリックします。プロンプトに従って、スライドホルダーと収集プレートを取り外します。スライドをTBSTで保管するか、水性媒体で覆い、長期保存のためにスリップを覆います。
透水性シールを使用してプレートをシールし、上部を開いた状態でサーマルサイクラーで摂氏65度で吸引液を乾燥させます。7マイクロリットルのジエチル炭酸塩処理水を加えて混合する。室温で10分間インキュベートした後、すばやくスピンダウンします。
テキストプロトコルで説明されている式を適用して、適切なプローブRおよびプローブU方程式を選択して、プローブバッファーミックスを準備します。84マイクロリットルのプローブバッファーミックスを各ハイブリダイゼーションコードパックに追加します。新鮮な96ウェルハイブリダイゼーションプレートに、8マイクロリットルの各ハイブリダイゼーションコードマスターミックスを、示された行の12ウェルすべてに加える。
7マイクロリットルをDSP収集プレートからハイブリダイゼーションプレート内の対応するウェルに移す。ヒートシールし、プレートを回転させ、摂氏67度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、プレートを氷上で冷却し、素早く回転させます。
各ウェルからのハイブリダイゼーション産物をストリップチューブにプールし、各ウェルを5回穏やかにピペッティングします。スピンダウンし、ストリップチューブを分析システムにロードします。DSP計測器でCDFファイルをUSBドライブに保存し、データをデジタルアナライザに転送します。
画面で、[処理の開始]を押します。[高感度]、[次へ]の順に選択します。サンプルを含むウェルの数に対して [すべて選択] を押し、電子メール通知で [完了]、[次へ] の順に押します。
次に、[開始]をクリックします。準備ステーションが完了したら、カートリッジを密封してデジタルアナライザに移します。カウント開始を押します。
[ステージ位置] を選択します。[既存のCDFファイルをロード]を押し、以前にアップロードしたファイルを選択します。[完了]を押します。
もう一度[ステージ位置]を選択し、[完了]、[開始]の順に押してプログラムを実行します。解析システムからのレポーター数変換ファイルのZIPファイルをUSBドライブに保存します。ドライブをDSPマシンに挿入します。
DSPコントロールセンターで、[データ収集]にカーソルを合わせ、[アカウントのアップロード]をクリックします。関連する ZIP ファイルを選択します。DSPコントロールセンターの[レコード]をクリックします。
キュー内のスキャンを表示するには、[選択したスキャンをキューに追加]、[マイ分析キュー] の順に選択します。コントロールセンターのデータ分析オプションにカーソルを合わせて、キューから新しいスタディを選択します。DSP実験は膠芽腫のサンプルに対して行われ、その結果はヒートマップとして視覚化されました。
行はタンパク質ターゲットを表し、各列は関心領域に対応します。発現レベルは、低い発現を示す青から、高い発現を示す赤まで変化する色の範囲で表される。列内の色のばらつきは、地域のタンパク質の不均一性を反映しており、タンパク質発現の違いとの空間的関連の可能性を示唆しています。
この実験では、S100とCD-56は神経マーカーであるため、普遍的に高かった。最も変動性の高いマーカーには、腫瘍の増殖、遊走、転移に関連することが知られているB7-H3、KI-67、CD-44、およびフィブロネクチンが含まれます。DSPは、膨大な数の候補ターゲットから、大きな地域差を示すターゲットを特定できます。
これは、変動性に関連する要因と病気との関連性を調査するための基礎を築きます。
