細胞および細胞内分解能で3Din vitroモデルを特性評価することは、完全な活用に不可欠ですが、困難な場合があります。したがって、100マイクロメートルから数ミリメートルの範囲の固定3Din vitroモデルの染色および細胞内分解能イメージングのための補完的なプロトコルを提供しました。3D 構造は放射状であり、慎重に操作する必要があります。
ピペッティングする前に、チューブ内の3D構造の位置を確認して、吸引を回避してください。オルガノイドやスフェロイドなどの小さな構造の埋め込みに古典的な手法を採用しているため、視覚化された指示は、初めてのユーザーがタスクをより簡単に実行するのに役立ちます。私と一緒に手順を実演するのは、病理学研究プラットフォームのラボ技術者であるローラ・フランコルスです。
3Dホールマウント染色用のサンプルを調製するには、BSAで事前にコードされた1ミリリットルのピペットチップを使用して、1ミリリットルの3D構造懸濁液を500マイクロリットルのPBSチューブに追加します。3D構造がチューブの底に落ち着いたら、PBSを500マイクロリットルの透過処理ブロッキング溶液で慎重に交換し、室温で1時間インキュベートし、毎分30〜50回転で穏やかな水平攪拌を行います。インキュベーションの最後に、3D構造を再び沈降させてから、BSAを添加した1ミリリットルの0.1%PBSで3D構造を2回注意深く洗浄します。
最後の洗浄後、3D構造をPBS中の250マイクロリットルの一次抗体で2〜3日間標識し、摂氏4度で穏やかに水平に攪拌します。インキュベーションの最後に、1回の洗浄につき1ミリリットルの0.1%PBS BSAで5回の3分間洗浄と2回の15分間洗浄でサンプルを洗浄します。最後の洗浄後、3D構造をPBS中の250マイクロリットルの適切な二次抗体で、光から保護された穏やかな水平攪拌で摂氏4度で24時間標識します。
翌日、3D構造に250マイクロリットルの適切な濃度のHoechst 3342を標識し、摂氏4度で穏やかな水平攪拌で2時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、実証されているように、3D構造を3分間5回、洗浄ごとに1ミリリットルのPBSで15分間2回洗浄します。最後の洗浄後、3D構造を96ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレートに移し、気泡を避けて200マイクロリットルの透明化溶液を構造にそっと加えます。
次に、アルミホイルで覆われたプレートを摂氏4度で少なくとも48時間置きます。大規模な3D細胞培養モデルを埋め込むには、BSAコーティングされた1ミリリットルのピペットチップを使用して、PTFEで裏打ちされたボトルキャップ付きの平底ガラスチューブに3D構造を慎重に移します。構造が落ち着いたら、PBSを70%エタノールで慎重に交換し、室温で30分間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、70%エタノールを1ミリリットルのすぐに使用できるエオジンY溶液と交換します。チューブをフリックし、構造を少なくとも30分間染色します。インキュベーションの終わりに、洗浄ごとに1ミリリットルの100%エタノール中で30分間連続して30分間洗浄して構造を脱水する。
最後の脱水の後、化学フードの下で洗浄ごとに1ミリリットルのキシレンで30分間連続して洗浄し、3D構造をクリアします。最後のキシレン浸漬後、キシレンに浸した生検パッドを白いマイクロツイン組織カセットの1つのコンパートメントに入れ、BSAコーティングされた2ミリリットルのプラスチックパスツールピペットを使用して3D構造をパッドに移します。3D構造を別のキシレンに浸した生検パッドで覆い、3D構造を所定の位置に保持し、カセットを閉じます。
すべてのサンプルを移したら、カセットを摂氏65度のパラフィン浴に30分間入れてから、カセットを摂氏65度の新鮮なパラフィン浴に一晩入れます。翌朝、1サンプルにつき65°C加温した包埋型に流動パラフィンを加え、各型にパラフィン包埋試料を1個入れる。すべての3D構造が底に落ちるまで金型をゆっくりと攪拌し、摂氏65度で温めた細かい鉗子を使用して、3D構造を各金型の中央に配置します。
パラフィンが薄い固体層を形成するまで金型を冷却し、3D構造を所定の位置に固定します。ティッシュカセットを置き、型の上にホットパラフィンを追加します。パラフィンが完全に固まったら金型を取り外します。
小さな3D細胞培養モデルを埋め込むには、洗浄ごとに1ミリリットルのTBSで3D構造を3回穏やかに洗浄します。最後の洗浄後、構造に触れずにできるだけ多くのTBSを取り除き、市販のパラフィン包埋キットから2滴の試薬2滴を加えます。軽くたたいて軽く混ぜ、ゲルが固まるまで軽くたたく試薬を2滴加えます。
細かい鉗子を使用して、キットから事前に組み立てられたカセットのウェルからゲルを移し、示されているように、ドラフト内で30分間上昇するエタノールとキシレンのインキュベーションでゲル包埋サンプルを脱水します。最後のキシレン浸漬後、カセットを摂氏65度のパラフィン浴に一晩置いてから、細かい鉗子を使用して、パラフィン包埋サンプルを摂氏65度で加温した包埋型を装填した流動パラフィンの中心に移します。次に、大規模な3D細胞培養モデルで実証されたように、もう1つのパラフィン層で3D構造を固定します。
3次元ホールマウント染色と共焦点顕微鏡は、3D培養モデルの細胞組成と空間位置に関する視覚情報を最大200ミクロンの深さのフィールドまで提供します。このプロトコルを使用して3D構造に対して取得できる高分解能により、細胞数の定量化および異なる細胞サブタイプ内のさまざまな細胞マーカーの検出に、細胞および細胞内セグメンテーションアルゴリズムを適用できます。3Dホールマウント解析は、構造全体に関係なく、深さ200ミクロンまでの視覚化されたセルに適用できます。
それどころか、2D断面分析は、あらゆるサイズの細胞に関する洞察を提供することができます。
