接着性細胞は周囲に力を発揮し、それらの力には、緑色で示されている細胞が基質に及ぼす力と、細胞が隣接する力を赤色で示す。これらの力は、単層応力顕微鏡と呼ばれる技術を用いて細胞単層で測定することができる。簡単に言えば、この技術は、上面のすぐ下に小さな蛍光ビーズを含むヒドロゲルと、ガラスに接着された大きな蛍光ビーズを調製することを含みます。
このヒドロゲルでは、細胞を見て、合流するか、または力を測定するために望む状態にそれらを培養します。力の測定は、細胞単層をイメージングし、細胞の透過光画像を撮影し、小さなビーズと大きなビーズの蛍光光画像を必要とします。これらの画像のそれぞれは、同じボーカルプレーンで取得されます。
これらの画像は、細胞が結合され、ヒドロゲルから切り離されたときに取得されます。そして、これら2つの画像のセットを比較すると、これらすべての力を定量化するために必要なデータが提供されます。そこで、AcTrMとAnViMが遊びに来ます。
セルをプレートした後、任意のインスタンスでまったく同じ場所で画像を取得するために、そのプロトコルはAcTrMにプログラムされ、その後、このデータを分析し、結果を可視化するために、AnViMの目的です。次の数分で、合流セル単層の画像を取得するプロセスを見ていきます。アクション ステップ 0 は、取得タイプを選択するように求めるプロンプトを表示します。
新しい実験を開始するための新しい買収、または以前の実験を再開するための継続的な買収。[新規取得] をクリックして、職位リストを作成します。アクションステップ1は、次のステップのすべてを一覧表示します。
そして、これらのアクションは、ここでステージの位置リストウィンドウで行われます。手動調整のサンプルを視覚化するには、[ライブ イン マイクロ マネージャー] をクリックします。ライブビューでは、フェーズを見てみましょう。
ここでは明らかです。さて、ビーズを見る必要があります。ここで、ビーズは蛍光で可視化することができる。
だから、トップビーズに適したチャンネルを選択します。また、いくつかのボトムビーズを見ることができることも重要ですので、下部のビーズのチャンネルを見てみましょう。ここで見えるのは下のビーズのぼやけた画像であり、この画像で可能な下のビーズがそこにあることを知ることができる限り、それは完全に問題ありません。
位置リストで、[マーク] をクリックします。このようにして、職位リストを作成します。前のビデオで説明した位置リストを作成した後、多次元取得ウィンドウを使用して、手順 2 の手順に従います。
長いタイムラプスを実行したいとしましょう。ここでは、撮影したい画像の数を示します。最初のチャネルはフェーズチャネルになります。
次のものはトップビーズになり、その後のビーズは下のビーズになるでしょう。多次元取得ウィンドウで閉じる をクリックし、AcTrM ステップ 2 で[OK]をクリックします。出力は、多次元取得ウィンドウで指定されたディレクトリに保存されます。
アクションステップ3は、実験が回復を必要とするかどうか尋ねます。答えは通常はイエスになります。ここでiTACSは、洗練された回復を実行したいですか?
この最初の部分は、洗練された回復にかなり近づくでしょうが、下の部分は私たちを再配置のより高い精度にさらに近づけるつもりです。限られた視野を使用してリカバリを行う場合は、このオプションが提供されますが、この実験では、このオプションは選択されません。この時点で、一連の参照画像の取得が完了し、Micro-Managerを閉じることができます。
画像取得の場合、AcTrMを起動します。拡大率を選択し、データフォルダを含むディレクトリを選択します。プレートの位置を変更する場合は、位置変更に使用するチャネルを選択します。
カメラで現在見られるものを保存した画像と一致させるインターフェースが用意されています。重なりが存在する場合、画像は黒と共に赤と緑の色を表示し、手動調整を行うことができます。それ以外の場合は、ヒット受け入れ、および取得が進みます。
これでフィジーを始めることができます。MSM ドロップダウン メニューの最初のオプションを選択します。次に、tnimgs フォルダを含むフォルダを選択します。
次に、どのチャンネルがどの画像に対応するかを定義する必要があります。この例では、チャンネル0は、細胞の位相コントラスト画像である透過光画像である。下のビーズイメージはチャンネル 2 で、上端のビーズイメージはチャンネル 1 です。
そして、細胞が交差する場所と画像のどちら側を横切っているのかを尋ねています。この場合、セルは右端に向かって進む単層であるため、右の選択を解除して続行します。ここでは、単層から遠く離れた上のビーズの小さな領域は、ここに示されているものよりもまばらで大きく見えるボトムビーズ画像と同じ目的を果たします。
今では、ビーズが目立つように明るさとコントラストを変更したいかどうかを尋ねています。そこで、メニューのスライダーバーを使用して調整し、ビーズが目立つように表示されたら[OK]をクリックします。そして今、私たちは位置補正を行います。シフトがあれば、それを取り除くでしょう。
完了すると、分析フォルダーが作成されます。解析フォルダ内に位置フォルダ P0 が作成され、前のプリプロセスメニューで選択した内容は、交差したエッジ、ピクセルサイズ、位相コントラストなどの選択項目に保存されます。単層応力顕微鏡、または MSM ドロップダウン メニューで、[MSM ゲル変形]を選択します。
ここから、ビーズの分布に適したオプションを選択します。データが処理されると、新しい移動フォルダが position フォルダに表示されることがわかります。これは、すべての出力ファイルが格納される場所です。
これは、分析が完了したことを示します。細胞-ECM接合と細胞-細胞接合、また単層の個々の細胞の細胞骨格を横切って作用する力を計算する方法を見ていこう。そのためには、3 番目のオプションを選択します。
そして、1つはtnimgsと分析フォルダを含むディレクトリを選択することです。選択をヒットし、それはあなたに尋ねるでしょう、このゲルのせん断弾性率は何ですか?せん断弾性率は1250であり、この例ではヒドロゲルの厚さは118ミクロンである。
予想されるノイズレベルは、ここで提供されます。次に、平均変位はゼロフラグであり、この場合はチェックされません。OK を選択すると、トラクションを計算する実装は、このバージョンの AnViM で実装される MATLAB 関数を介して実行されます。
これで、細胞細胞または細胞骨格力の計算を行う準備ができました。そして、最初に尋ねる質問は、単層はコンフルエントですか?この特定のケースでは、我々は前進する単層を有し、フレームの右側に細胞領域がない。
だから答えは、単層がコンフルエントではないということですので、私たちはノーと言うつもりです。次に、最大の非セル オブジェクトの周囲にポリゴンを描画するように求められます。セグメンテーションに適した方法を選択します。
ここでは、方法3と4で細胞の色を示すように求めているので、ここでは細胞が黒いので、黒を選択します。これらの異なる方法から生成されるセグメンテーションは、セルの単層にいくつかの穴と、セル領域内のいくつかの白い領域で終了します。ここでは、選択し、自動的にスポットを埋め、ヒット OK.So、すべてのスポットが単層に埋め込まれ、セル領域がありません。
そして、次に、セルラー単層の機械的応力を計算します。すでに第1部を実行して、セルのない領域からセルをセグメント化したので、このステップは個々のセルと画像のセグメント化であるパート2から始めます。1つは、個々のセルのセグメンテーションを選択することです。
ここで、位置ディレクトリを選択するように求めています。これらのパラメータについては、ここで説明する情報がいくつか存在します。次に、最小の法線セルの周囲にポリゴンを描画するように求められます。
したがって、ここで描いたものは面積の計算に使用され、これより小さいものはセルとして定義されないことを規定します。そして次に、最大のセルを求めます。そこで、最大の通常セルの周りにポリゴンを描画し、どちらが明るいかを尋ねます。
セルとセルのインターフェースは明るいか、セルの中心が明るいか。だから、この場合、セルとセルのインターフェイスは明るいので、セルとセルのインターフェイスを選択します。これは、計算が完了したことを示します。
まず、セルの強度に関するマップを選択します。まず、iTACS は、P0 フォルダとも呼ばれる位置ディレクトリを選択するようにユーザに要求します。完了したら、[選択] をクリックします。
次に、ユーザーはiTACSが細胞分裂を検出するか、細胞蛍光を定量化することを望んでいるのかを尋ねられます。この場合、細胞内に蛍光タンパク質が存在しなかったので、細胞分裂の検出を選択します。次のスライドでは、隣接する領域のサイズを定義するユーザーを可能にする、これは、AnViMが、個々のセルのプロパティと隣接する領域のプロパティを調べ、実行するユニークな分析です。
ここでは、ユーザーは隣接する領域のセルの幅を選択できます。この場合、60 ピクセルの隣接領域を定義します。最初のチェックボックスは、iTACSにセルのプロパティを収集するかどうかを尋ね、はい、このチェックボックスはiTACSに隣人のプロパティを収集するかどうかを尋ねます。
これらのチェック ボックスの下に、各チェック ボックスの詳細をユーザーが望む場合は、iTACS がチェック ボックスの詳細を提供します。これは、分析が完了したことを示します。ここでも、iTACS はユーザに位置ディレクトリの選択を要求します。
次に、力データのマッピング、力データの画像の作成、速度データのマッピング、速度データの画像の作成を選択できます。イメージの作成には時間がかかるので、今すぐ作成するか、後で実行するのを待つことができます。そのため、ユーザーには選択肢を選択するオプションが与えられます。
ここでは、iTACS は、ユーザーに隣接領域のサイズを再度決定するように要求し、この場合は 60 ピクセルのマッピング強度に対して決定したのと同じサイズを使用できます。また、ユーザーは、セルとその隣接領域のプロパティを収集するように求められます。これは、分析が完了したことを示します。
単層応力顕微鏡(MSM ドロップダウン メニュー)で、結果トラック データを選択します。まず、iTACS は、P0 フォルダとも呼ばれる位置ディレクトリを選択するようにユーザに要求します。完了したら、[選択] をクリックします。
ここでは、iTACS は、どのフレーム番号から iTACS がデータの追跡を開始することを望むかを尋ねます。フレーム番号 1 の速度を決定できないため、フレーム番号 2 からトラッキングを開始するのは非常に安全です。ここでは、iTACS は同時に満たすプロットの最大数を示すようにユーザーに要求します。
そして、基本的に、これはデータ追跡を促進する方法です。完了したら、[OK]をクリックすると、トラッキング中に変数を選択するためのオプションが、ヒート マップを生成するオプションと同様の方法で表示されます。関心のある共通プロパティは、ウィンドウの上部にあるテキスト ボックスに表示されます。
ただし、変数をカスタマイズする場合は、テキスト ボックス内のすべてを削除し、以下に示す特定のプロパティを選択するだけです。単層応力顕微鏡(MSM ドロップダウン メニュー)で、結果プロットを選択します。その後、iTACS は、ユーザーがトラックが切れ目のないセルにプロットを制限するかどうかをユーザーに尋ねます。
切れ目のないトラックにプロットを制限しない場合は、[いいえ]をクリックしますが、トラックが切れ目のないセルにプロットすることを制限する場合は、[Yes Here iTACS]をクリックして、プログラムにプロットする変数の数を尋ねます。iTACSは最大3つの変数をプロットすることができ、この場合、これらの因子間の関係を確認するために2つの変数のみをプロットします。単層応力顕微鏡(MSM ドロップダウン メニュー)で、結果画像を選択します。
ここに位置ディレクトリがあり、完了したら[選択]をクリックします。iTACSは開始フレームを選択するように私たちに求めます。ここでは、フレーム番号 2 を選択しました。
ヒート マップを作成するオプションは、個々のセルのタイム トラックをプロットするオプションと同様の方法で表示されます。それで、ヒートマップの作り方を締めくくります。ここで、細胞番号1の細胞細胞の緊張における細胞速度の経時トレースを表す。
プロパティは共有縦軸に表示され、横軸は時間インスタンス数を示し、フレームは 15 分間隔で取得されます。2 番目の出力は、実験に 1 時間のヒート マップの配列です。ここに示す特性は、広域、向き、円形性、速度、運動方向、最大張力方向、細胞骨格張力、基質牽引力、および個々の細胞の張力異方性を含む。
だから、これは実験の1セットを垣間見ることができます。AnViMとAcTrMがユーザーが実験を再現的に行う手助けをする実験的な状況は他にもいくつかあります。iTACSの主な機能の一部には、実験プロトコルの自動化、自動データ分析、エンジニアリングのバックグラウンドが不要などがあります。
