表面結合プローブを用いた単一分子FRET実験は、これまでほぼ固定化された分子に対して行われてきました。しかし、多くの生体分子が拡散し、我々の方法で分析することができます。単一分子FRETと追跡を組み合わせることで、FRET欠乏時間の経時的な移動プローブの解析だけでなく、拡散挙動などの時空間的な側面を調べることができます。
当社の方法は、さまざまな異なるFRETベースのプローブと互換性があります。例えば、生細胞実験における分子力、立体ダイナミクス、結合運動に関する洞察を提供することができます。高品質の単一分子FRET実験は、悪名高い実行が困難です。
信頼性の高い定量を行うためには、良好な信号対雑音比と十分な長さの単一分子トラックでデータを記録することが重要です。サンプル測定を開始するには、ドナーとアクセプターの蛍光体を励起して、カメラをトリガーしながら適切な照明時間を得て、カメラの読み出しが有効になるまで待ちます。ドナーとアクセプター蛍光色素の励起を代わりに繰り返します。
一分子シグナルを凝集体から識別する段階的な光漂白分析を可能にする視野内のプローブ当たり少なくとも1つの蛍光色素の光化を確実にするのに十分な大きさの繰り返し数を選択します。記録された画像シーケンスからのイメージセグメンテーション用のフレームだけでなく、ドナーとアクセプタの励起フレームを選択できるようにする照明シーケンスを指定します。同時に、同じ照明設定を使用して記録されたデータセットを解析します。
この処理を行うために、各データセットに、それぞれのイメージ シーケンスのファイル名に一致する識別子とパターンを割り当てます。また、画像登録用の受託者マーカーの記録、フラットフィールド補正用の励起光プロファイル、オプションでドナー専用サンプルおよびアクセプタ専用サンプルなど、特別な目的に特化したデータセットを定義して、補正係数を決定します。次に、両方のチャンネルが 1 つのカメラを使用して記録される場合は、発光チャネルと生画像を選択します。
このためには、適切なグラフィカルウィジェットを使用して、ドナーとアクセプターの放出に適した領域を選択し、両方の放出チャネルで受託マーカーをローカライズし、画像登録を行います。提供されたユーザーインターフェイスを使用して、ドナーとアクセクサーの両方の放出チャネルのローカリゼーションアルゴリズムに適したパラメータを見つけます。次に、ドナーとアクセプターの放出から得られた画像の合計にドナー励起時にFRETプローブの単一分子局在化パラメータを設定し、アクセプタ放出チャネルでアクセプタ励起時のプローブのローカリゼーションパラメータを設定します。
すべてのフレームでドナーとアクセプター励起にFRETプローブを局地化します。結果は、元のフレーム番号、2 次元座標、およびソース イメージ ファイルを参照する識別子を含む 1 つのテーブルにマージされます。蛍光強度を追跡および測定するには、トラックピークアルゴリズムに適切なオプションを選択して、FRETプローブのローカリゼーションを軌道にリンクします。
次に、解析ソフトウェア機能を使用して、画像配列から補助画像データを処理する。励起シーケンスで S によってマークされたセグメンテーションを容易にするために記録された追加の画像を抽出します。最後に、密に標識されたサンプルに記録された画像から、視野全体のドナーおよびアクセクサ励起光プロファイルを決定します。
初期のフィルタリングステップでは、それらの蛍光強度を確実に決定することが困難であるため、重なり合うポイントスプレッド機能を持つ信号を廃棄します。不均一な照明の場合、良好な信号対雑音比を確保するために、視野内の明照領域内の信号のみを受け入れます。分子内FRETを研究する場合は、画像配列の最初から存在する軌道に解析を制限する。
次に、先に得られた励起光源プロファイルを使用して、不均一な照明によって生じる位置依存的蛍光強度変動を逆転させる平坦なフィールド補正を実行し、次いで、見かけのFRET効率と見かけのストイチオメトリーを計算する。単一分子プローブと凝集体を識別するための光漂白の段階的な分析を行うには、ドナーとアクセクサ励起の際に変化点検出アルゴリズムの適切なパラメータを見つけます。次に、変更点検出アルゴリズムを実行します。
あいまいな光の漂白動作を示すトラックを削除するには、蛍光色素が漂白されていると見なされる強度しきい値を定義してから、次のいずれかのオプションを選択します。受付者が部分的な漂白を示さない間、アクセクター蛍光色素の漂白を一歩でするオプション1。オプション2は、ドナーが部分的なアクセクサ剤漂白がない間に一歩で漂白する。
オプション3は、どちらかのフルオロフォア漂白剤を一段階で、他方は部分的に漂白しない。そして、ドナーとアクセプターフルオロフォアが単段階の光漂白または全く光漂白を示さないオプション4。次に、アクササイザチャネルへのドナー排出漏出、直接アクソシテクサ励起、検出効率、励起効率の補正係数を計算します。
次に、補正係数を用いて、見かけの効率とストイチオメトリーから見かけの測定からFRET効率を算出する。さらにフィルタリングする場合は、各軌道の最初の漂白イベントの前のデータ点のみを選択します。さらに、分析を単一分子プローブに制限するには、適切なストイチオメトリー限界内のデータポイントの少なくとも75%を持つ軌道のみを受け入れます。
次に、適切な補助画像に対してグローバルまたは適応しきい値法を使用して画像セグメンテーションを実行し、視野内の異なる領域に解析を制限します。効率と量乗法プロットを作成して、誤ったストイチオメトリーの信号が正しく識別され、除去されたことを確認します。次に、FRET効率のヒストグラムをプロットして、FRET効率分布の十分に確立された概要を提供し、ヒストグラムをグループ化して、異なる実験の結果を簡単に比較します。
科学的なPythonライブラリを利用して、例えば拡散解析を行って、ノートブック内のデータをさらに評価することが可能です。単一分子FRETイベントの可視化と追跡を以下に示します。フィルタされたFRETイベントは、FRET効率ヒストグラムの効率とストイチオメトリープロットで表されます。
さらに、移動度パラメータは、XYプロットまたは平均平方変位プロットで個々の軌道経路をプロットすることによって調べることができます。当社のプラットフォームの出力により、モバイルプローブのFRET効率時間トレースの遷移をさらに特定できます。例えば、生体分子の立体構造変化を評価する。
FRETベースの力センサーを使用して、分析プラットフォームは、初期のT細胞シグナル伝達中に免疫シナプス内の単一分子力イベントを定量化することができました。
