NEPTUNE permite la focalización y manipulación genética del sistema nervioso embrionario del ratón desde el día embrionario 7.5 y permite la generación de modelos de knockdown o rastreo de linaje en días. Este protocolo es adaptable, flexible y rápido. Podemos entregar shRNA, cdRNA o bibliotecas virales con código de barras para abordar diferentes preguntas en días en lugar de meses o años.
Esperamos que NEPTUNE proporcione información en neurociencia, pero también se puede adaptar a otros sistemas de órganos. Identificar la cavidad amniótica puede ser bastante difícil, así que tómese su tiempo para mirar la imagen de ultrasonido y tal vez tenga un libro de texto u otro recurso de anatomía a mano. Para comenzar a cargar la aguja, deslice la aguja de vidrio sobre el émbolo de metal, manteniendo la pinza unida pero ligeramente aflojada.
Luego, empuje la aguja capilar junto con el émbolo metálico a través de la junta delantera hasta que llegue al espaciador. Presione Empty para empujar el émbolo dentro de la aguja y expulsar el aceite de la punta de la aguja. Luego presione Rellenar para crear una burbuja de aire, dividiendo el aceite y la solución.
Finalmente, baje la aguja, sumerja la punta en la solución y presione Rellenar nuevamente para cargar la aguja. Después de fijar un ratón hembra anestesiado con cavidades amnióticas de tamaño ideal en la mesa de calentamiento, aplique gel para los ojos en ambos ojos para evitar la desecación corneal e inyecte un analgésico por vía subcutánea. Luego, esterilice la parte inferior del abdomen limpiando con un paño empapado con 0.5 miligramos por mililitro de solución de clorhexidina y seque la piel.
Luego, usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión vertical de 1.5 a 2 centímetros en la línea media de la piel en la parte inferior del abdomen. Luego levante la piel suavemente y libérela de la capa muscular subyacente aproximadamente un centímetro alrededor del punto de incisión para facilitar la sutura después de la cirugía. A continuación, haga una incisión vertical de un centímetro en la línea media en la capa muscular.
Usando un par de fórceps, levante un lado de la piel y la capa muscular, y con otro par, busque los cuernos uterinos. Luego, usando fórceps, sostenga el tejido entre los embriones y saque con cuidado ambos cuernos uterinos del abdomen. Cuente y numere los embriones, ya sea desde el ovario hasta el cuello uterino o desde el cuello uterino hasta el ovario, en ambos lados.
Luego, con un hisopo de algodón húmedo, empuje suavemente todos los embriones hacia la cavidad abdominal, excepto los tres primeros que se inyectarán. Luego, coloque una gota de PBS en una membrana elástica pegada a la abertura central redonda de una placa de Petri modificada disponible comercialmente y sosténgala inmediatamente por encima de los embriones. Inserte fórceps cerrados en la incisión del elástico, luego suelte los fórceps para abrir la incisión elástica, dejando caer el líquido sobre los embriones.
Usando fórceps, tire de la sección del útero correspondiente a los tres embriones a través del elástico y pose suavemente la placa de Petri en el abdomen del ratón. Usando cuatro pies de arcilla, asegure y fije la placa de Petri sobre el abdomen para reducir la presión sobre el ratón y también reducir la sensibilidad de las imágenes a la respiración y los latidos del corazón del ratón. Luego, usando fórceps y un hisopo de algodón húmedo, ajuste el útero y el elástico para asegurarse de que el elástico esté sellado alrededor de la piel del ratón, evitando fugas de PBS.
Luego, para fijar el útero, presione el cilindro de arcilla de modelar hacia abajo a la derecha de los embriones o el útero y agregue PBS a la placa de Petri hasta que los embriones y el útero estén completamente cubiertos con el PBS. Para facilitar el registro de las inyecciones, sumerja la sonda de ultrasonido en el PBS y ajuste el ratón o la mesa quirúrgica para que el primer embrión esté alineado con la sonda de ultrasonido. Escanee a través de los tres embriones e inspeccione las cavidades amnióticas.
Luego, usando la máquina de ultrasonido, mida el diámetro de la cavidad amniótica para determinar el volumen de inyección apropiado. Usando el controlador de inyección, ajuste los volúmenes de inyección determinados y la velocidad de inyección a disminuir, con una velocidad de inyección de 23 nanolitros por segundo. Después de bajar la aguja en el PBS, utilizando las ruedas principales del sistema de riel, presione Empty en el controlador del nanoinyector hasta que el líquido llegue a la punta de la aguja.
Luego, levante la aguja fuera del PBS y presione Inyectar para verificar que se descargue una gota del volumen deseado aproximado. Baje la aguja en el PBS nuevamente y mueva el nanoinyector con la rueda del plano Y en el micromanipulador para alinear la aguja con la sonda de ultrasonido y el embrión. Ajuste el ángulo de la aguja con la rueda angular de inyección para asegurar un ángulo de inyección casi perpendicular en relación con la pared uterina.
Luego, usando la rueda de inyección en el micromanipulador, inserte la aguja en la cavidad amniótica en un solo movimiento. Si la punta de la aguja desaparece de la imagen de ultrasonido, mueva la sonda hacia adelante o hacia atrás para volver a enfocar la aguja. Luego, inyecte el volumen deseado presionando Inyectar durante el número apropiado de veces.
Después de inyectar el volumen requerido, espere de 5 a 10 segundos antes de retraer la aguja en un movimiento suave. Mueva la etapa al siguiente embrión y repita la inyección para los otros dos embriones como se demuestra. A continuación, levante la sonda de ultrasonido y la aguja fuera del PBS usando el micromanipulador, alejando la aguja del operador para evitar daños y lesiones.
Usando fórceps, coloque el primer y segundo embriones de nuevo en el abdomen empujándolos suavemente a través del elástico. Luego, agarre suavemente el tejido adyacente al tercer embrión y tire del útero hacia el extremo superior de la incisión elástica. Tire suavemente del cuarto al sexto embrión con fórceps y permita que el tercer embrión vuelva a entrar en el abdomen.
Después de inyectar todos los embriones con cavidades amnióticas óptimas, empuje suavemente los embriones y el útero hacia el abdomen del ratón. La transducción exitosa de la placa neural da como resultado embriones con una fuerte expresión de un reportero fluorescente en el cerebro y otros tejidos derivados del ectodermo, como la piel. La inyección de volúmenes excesivamente altos puede provocar defectos del tubo neural, como exencefalia.
Las inyecciones exitosas en el día embrionario 7.5 dan como resultado una transducción uniforme del cerebro anterior al cerebro posterior, incluido el plexo coroideo. Las inyecciones de título bajo dan como resultado la transducción de clones unicelulares, mientras que el virus de título alto transduce casi el 100% de todo el cerebro. Las secciones coronales hasta embriones embrionarios del día 13.5 mostraron una transducción alta y uniforme del tejido neural del ojo, el cristalino, la córnea y el mesénquima.
Después de la inyección en el día embrionario 9.5, las glándulas salivales y los conductos se desarrollan alrededor del día embrionario 11.5 del epitelio oral. El epitelio lingual de la lengua está bien transducido, mientras que el mesénquima subyacente es negativo. Además, los grupos positivos dentro del epitelio lingual están separados por secciones negativas, lo que sugiere la transducción de la superficie del papilar.
Las inyecciones en el día embrionario 7.5 dan como resultado una transducción generalizada del mesénquima de la lengua en el día embrionario 13.5, lo que sugiere que las inyecciones tempranas se dirigen a las células de la cresta neural, contribuyendo al mesénquima en la lengua. Las inyecciones lentivirales también conducen a una orientación generalizada del sistema nervioso central y periférico, transduciendo neuronas y progenitores en la médula espinal, así como los ganglios de la raíz dorsal. Una buena preparación es esencial.
Asegúrese de que no haya fugas y que los embriones estén bien fijados, de modo que pueda concentrarse completamente en las inyecciones en la cavidad de la rata. Después de NEPTUNO, el análisis se puede realizar mediante varios métodos, como el análisis inmunofluorescente del cerebro, la secuenciación de ARN de una sola célula o permitir que los embriones inyectados nazcan para el análisis del comportamiento.
