NEPTÜN, embriyonik 7.5. günden itibaren fare embriyonik sinir sisteminin hedeflenmesine ve genetik manipülasyonuna izin verir ve günler içinde nakavt veya soy izleme modellerinin üretilmesini sağlar. Bu protokol uyarlanabilir, esnek ve hızlıdır. Farklı soruları aylar veya yıllar yerine günler içinde ele almak için shRNA, cdRNA veya barkodlu viral kütüphaneler sunabiliriz.
NEPTÜN'ün nörobilimde içgörüler sağlayacağını umuyoruz, ancak diğer organ sistemlerine de uyarlanabilir. Amniyotik boşluğu tanımlamak oldukça zor olabilir, bu nedenle ultrason görüntüsüne bakmak için zaman ayırın ve belki de elinizde bir ders kitabı veya başka bir anatomi kaynağı bulundurun. İğneyi yüklemeye başlamak için, cam iğneyi metal pistonun üzerine kaydırın, koletin bağlı kalmasını sağlayın, ancak hafifçe gevşetin.
Ardından, kılcal iğneyi metal pistonla birlikte ara parçaya ulaşana kadar ön contadan geçirin. Pistonu iğnenin içine itmek ve yağı iğne ucundan dışarı atmak için Boş tuşuna basın. Ardından, yağı ve çözeltiyi bölen bir hava kabarcığı oluşturmak için Doldur düğmesine basın.
Son olarak, iğneyi indirin, ucu çözeltiye batırın ve iğneyi yüklemek için tekrar Doldur'a basın. Isıtma masasında ideal boyutta amniyotik boşluklara sahip anestezi uygulanmış bir dişi fareyi sabitledikten sonra, kornea kurumamasını önlemek için her iki göze de göz jeli uygulayın ve deri altından bir ağrı kesici enjekte edin. Daha sonra, mililitre klorheksidin çözeltisi başına 0.5 miligram ile ıslatılmış bir bezle silerek alt karnı sterilize edin ve cildi kurutun.
Daha sonra, cerrahi makas kullanarak, alt karın bölgesinde 1.5 ila 2 santimetrelik dikey orta hat cilt kesisi yapın. Daha sonra cildi nazikçe kaldırın ve ameliyattan sonra dikiş atmayı kolaylaştırmak için insizyon noktasının yaklaşık bir santimetre etrafındaki altta yatan kas tabakasından serbest bırakın. Daha sonra, kas tabakasına bir santimetrelik dikey orta hat kesisi yapın.
Bir çift forseps kullanarak, cildin ve kas tabakasının bir tarafını kaldırın ve başka bir çiftle uterus boynuzlarını arayın. Daha sonra, forseps kullanarak, embriyolar arasındaki dokuyu tutun ve her iki uterus boynuzunu da karından dikkatlice çekin. Her iki taraftaki yumurtalıktan servikse veya serviksten yumurtalıklara kadar embriyoları sayın ve numaralandırın.
Daha sonra, nemli bir pamuklu çubukla, enjekte edilecek ilk üçü hariç, tüm embriyoları nazikçe karın boşluğuna geri itin. Daha sonra, ticari olarak temin edilebilen modifiye edilmiş bir Petri kabının yuvarlak merkezi açıklığına yapıştırılmış elastik bir zar üzerine bir damla PBS yerleştirin ve embriyoların hemen üzerinde tutun. Elastik insizyona kapalı forseps yerleştirin, ardından elastik insizyonu açmak için forsepsleri serbest bırakın ve sıvıyı embriyoların üzerine bırakın.
Forseps kullanarak, üç embriyoya karşılık gelen uterus bölümünü elastik yoldan çekin ve Petri kabını farenin karnına hafifçe tüneyin. Dört kil ayağı kullanarak, fare üzerindeki baskıyı azaltmak için Petri kabını karın üzerine sabitleyin ve sabitleyin ve ayrıca görüntülemenin farenin nefes alma ve kalp atışına duyarlılığını azaltın. Daha sonra, forseps ve nemli bir pamuklu çubuk kullanarak, elastiğin farenin derisinin etrafına kapatıldığından emin olmak için uterusu ve elastiği ayarlayın ve PBS sızıntısını önleyin.
Daha sonra, uterusu sabitlemek için, modelleme kil silindirini embriyoların veya uterusun sağına bastırın ve embriyolar ve uterus tamamen PBS ile kaplanana kadar Petri kabına PBS ekleyin. Enjeksiyonların kaydedilmesini kolaylaştırmak için, ultrason probunu PBS'ye batırın ve fareyi veya ameliyat masasını, ilk embriyo ultrason probu ile hizalanacak şekilde ayarlayın. Her üç embriyoyu da tarayın ve amniyotik boşlukları inceleyin.
Daha sonra, ultrason makinesini kullanarak, uygun enjeksiyon hacmini belirlemek için amniyotik boşluğun çapını ölçün. Enjeksiyon kontrolörünü kullanarak, belirlenen enjeksiyon hacimlerini ve enjeksiyon hızını, saniyede 23 nanolitrelik bir enjeksiyon hızı ile yavaşlayacak şekilde ayarlayın. İğneyi PBS'ye indirdikten sonra, raylı sistemdeki ana tekerlekleri kullanarak, sıvı iğne ucuna ulaşana kadar nanoenjektör kontrolöründe Boş düğmesine basın.
Ardından, iğneyi PBS'den çıkarın ve yaklaşık istenen hacimde bir damlanın boşaltıldığını doğrulamak için Enjekte Et düğmesine basın. İğneyi tekrar PBS'ye indirin ve iğneyi ultrason probu ve embriyo ile hizalamak için nanoenjektörü mikromanipülatördeki Y-düzlemi tekerleği ile hareket ettirin. Rahim duvarına göre neredeyse dik bir enjeksiyon açısı sağlamak için enjeksiyon açısı tekerleği ile iğne açısını ayarlayın.
Daha sonra, mikromanipülatör üzerindeki enjeksiyon tekerleğini kullanarak, iğneyi tek bir hareketle amniyotik boşluğa yerleştirin. İğne ucu ultrason görüntüsünden kaybolursa, iğneyi tekrar odakta tutmak için probu ileri veya geri hareket ettirin. Ardından, uygun sayıda Enjekte Et düğmesine basarak istediğiniz hacmi enjekte edin.
Gerekli hacim enjekte edildikten sonra, iğneyi nazik bir hareketle geri çekmeden önce 5 ila 10 saniye bekleyin. Aşamayı bir sonraki embriyoya taşıyın ve gösterildiği gibi diğer iki embriyo için enjeksiyonu tekrarlayın. Daha sonra, mikromanipülatörü kullanarak ultrason probunu ve iğneyi PBS'den çıkarın, hasar ve yaralanmayı önlemek için iğneyi operatörden uzaklaştırın.
Forseps kullanarak, birinci ve ikinci embriyoları elastik yoldan yavaşça iterek tekrar karın içine yerleştirin. Ardından, üçüncü embriyoya bitişik dokuyu yavaşça kavrayın ve uterusu elastik insizyonun üst ucuna doğru çekin. Forseps ile dördüncü ila altıncı embriyoları yavaşça yukarı çekin ve üçüncü embriyonun karın içine tekrar girmesine izin verin.
Optimal amniyotik boşluklara sahip tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, embriyoları ve uterusu yavaşça farenin karnına geri itin. Nöral plağın başarılı bir şekilde transdüksiyonu, beyinde ve cilt gibi diğer ektoderm kaynaklı dokularda floresan muhabirin güçlü ekspresyonuna sahip embriyolarla sonuçlanır. Aşırı yüksek hacimlerin enjekte edilmesi, ekzensefali gibi nöral tüp defektlerine neden olabilir.
Embriyonik gün 7.5'teki başarılı enjeksiyonlar, koroid pleksus da dahil olmak üzere ön beyinden arka beyne düzgün bir transdüksiyonla sonuçlanır. Düşük titre enjeksiyonları, tek hücreli klonların transdüksiyonu ile sonuçlanırken, yüksek titre virüsü tüm beynin yaklaşık% 100'ünü dönüştürür. Embriyonik gün 13.5 embriyoları boyunca koronal kesitlerde göz, lens, kornea ve mezenkimde nöral dokunun yüksek ve homojen transdüksiyonu görüldü.
Embriyonik gün 9.5'te enjeksiyonu takiben, oral epitelden embriyonik gün 11.5 civarında tükürük bezleri ve kanalları gelişir. Dilin lingual epiteli iyi transdüe edilirken, altta yatan mezenkim negatiftir. Ek olarak, lingual epitel içindeki pozitif kümeler, papiller yüzeyin transdüksiyonunu düşündüren negatif kesitlerle ayrılır.
Embriyonik gün 7.5'teki enjeksiyonlar, embriyonik gün 13.5'te dil mezenkiminin yaygın transdüksiyonu ile sonuçlanır, bu da erken enjeksiyonların nöral krest hücrelerini hedef aldığını ve dildeki mezenkimlere katkıda bulunduğunu düşündürür. Lentiviral enjeksiyonlar ayrıca merkezi ve periferik sinir sisteminin yaygın bir şekilde hedeflenmesine yol açarak, omurilikteki hem nöronları hem de progenitörleri ve ayrıca dorsal kök gangliyonlarını dönüştürür. İyi hazırlık şarttır.
Sızıntı olmadığından ve embriyoların iyi sabitlendiğinden emin olun, böylece tamamen sıçan boşluğuna enjeksiyonlara odaklanabilirsiniz. NEPTÜN'den sonra analiz, beynin immünofloresan analizi, tek hücreli RNA dizilimi veya enjekte edilen embriyoların davranışsal analiz için doğmasına izin verilmesi gibi çeşitli yöntemlerle yapılabilir.
